Физиология человека, 2019, T. 45, № 5, стр. 99-109

МЕТОДИКА

Из числа пациентов Клинической базы ФГБНУ НИИОПП (ООО “КДО” г. Москва) отобрали 104 чел. средней возрастной категории (55 лет [49–59 лет]) с нарушенными параметрами липидного профиля: повышение концентрации ОХС выше 5.3 ммоль/л, ХС ЛНП 3.0 ммоль/л, триглицеридов (ТГ) более 1.8 ммоль/л, индекса атерогенности (ИА) более 4.0, снижение ХС ЛВП менее 1.0 ммоль/л). Критериями включения было отсутствие субъективных жалоб на момент забора крови для проведения анализов и инструментальных исследований; хронические заболевания в стадии ремиссии более трех месяцев или их отсутствие; отсутствие серьезных травм и операционных вмешательств не менее чем за месяц до проведения исследования. Критерии исключения: прием липидснижающих препаратов, острая воспалительная патология на момент включения в исследование, длительный прием препаратов с противовоспалительным действием, острое нарушение мозгового кровообращения или инфаркт миокарда в анамнезе, хроническая почечная или сердечная недостаточность, сахарный диабет. Все волонтеры на момент включения в исследование оценивали себя как “здоровые”. Индекс массы тела, рассчитанный по формуле Кетле, был в пределах 22.2–28.1 кг/м². Контрольная группа (“Контроль”) состояла из девяти человек, была сопоставима по полу и возрасту с обследуемыми и имела нормальные показатели липидного профиля. Всем пациентам проводили дуплексное сканирование экстракраниального отдела БЦА линейным датчиком с частотой 5–12 МЦ (УЗИ-сканер MEDISON SA9900, Южная Корея). При выявлении стенозирующего атеросклероза пациенты были исключены из исследования. На основании изменений в структуре стенки артерий, выявленных при ультразвуковом исследовании, пациентов разделили на три группы: у обследованных из группы “АСБ” (n = 57) в структуре стенки лоцировалась одна и более атеросклеротическая бляшка, в группе “ТИМ” (n = 20) отмечалось нарушение трехслойной структуры стенки БЦА с утолщением до 1.2 мм комплекса интима-медиа, пациенты группы “Норма” (n = 27) имели нормальную структуру стенки.

Забор венозной крови осуществляли кубитальным доступом в утренние часы (с периодом воздержания от приема пищи не менее 6 ч). Определяли такие параметры как: концентрация ОХС, ТГ, ХС ЛВП в ммоль/л с использованием биохимического анализатора “StatFax 3300” (США), набором реактивов фирмы “Analyticon” (Германия) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Общую фракцию ХС ЛНП (в ммоль/л) рассчитывали по формуле “ХС ЛНП = ОХС – ХС ЛВП-ТГ/2,2”, индекс атерогенности рассчитывали “ИА = (ОХС-ХС ЛВП)/ХС ЛВП”. Оценивали концентрацию ЛПС в плазме крови при помощи микро-ЛАЛ-теста (принятые за норму референтные значения 0.3–1.0 EU/мл, Патент РФ № 2 169 367, реактивы Sigma, США), основанного на способности ЭТ вызывать коагуляцию белковых фракций гемолимфы мечехвоста Limulus Polyphemus. Оценку результата проводили на сопоставлении формы полученных кристаллов с данными калибровочной шкалы. Концентрацию в сыворотке крови АТ к гидрофобной части молекулы ЛПС (АТ-ЛПС-ФОБ) (референтные значения нормы 170–220 у. е. о. п.) и АТ к гидрофильной части молекулы ЭТ (референтные значения нормы 390–430 у. е. о. п.) в условных единицах оптической плотности оценивали методом “СОИС-ИФА” (Патенты РФ № 2 609 763, № 2 011 993), который представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ. Антигеном к АТ-ЛПС-ФОБ выступал ЛПС Salmonella minnnesotа RE 595 (Sigma, США), антигеном для определения АТ-ЛПС-ФИЛ являлся E.coli O55 (Sigma, США). Регистрацию показателей экстинкции осуществляли на спектрофотометре “Immunochem 2100” (США) при длине волны 495 нм. Определяли соотношение АТ-ЛПС-ФИЛ/АТ-ЛПС-ФОБ (норма 2 : 1). Заполняли опросник, который включал такие параметры как пол, возраст, факт курения, уровень систолического артериального давления. Среди обследованных уровень артериального давления не был зафиксирован выше 150/90 мм рт. ст., что позволило классифицировать пациентов по бинарной системе: артериальная гипертензия (АГ) выявлена или нет, без деления по степени повышения артериального давления.

Статистическую обработку материалов исследования проводили с использованием программной среды вычислений Rstudio (1.1.456), пакетов прикладных программ Statistica 10 и SASJMP 11. Уровень статистической значимости был зафиксирован на уровне вероятности ошибки 0.05. С использованием критерия Колмогорова-Смирнова оценивали нормальность распределения выборки. Сравнения двух групп по количественным шкалам проводили на основе непараметрического критерия U-Манна-Уитни. Сравнения трех и более групп по количественным шкалам проводили на основе непараметрического критерия Краскела-Уоллеса. Для описания количественных показателей использовали медиану и внутриквартильный размах в формате “Mе [25; 75%]”.

Статистическую значимость различных значений для бинарных и номинальных показателей определяли с использованием критерия Хи-квадрат Пирсона. Корреляционный анализ проводили на основе непараметрической ранговой корреляции по Спирмену. При изучении взаимного влияния нескольких переменных проводили множественный регрессионный анализ. Оценка влияния фактора в распределении пациентов по группам происходила с использованием статистического однофакторного анализа рисков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В табл. 1 представлены результаты статистического анализа различных категориальных переменных, считающихся факторами риска развития атеросклероза, среди пациентов с разной степенью выраженности атеросклеротического поражения экстракраниального отдела БЦА.

По возрасту пациенты из групп “ТИМ” и “АСБ” старше, чем пациенты групп “Контроль” и “Норма”. Пациентов с артериальной гипертензией (АГ) существенно больше в группах “АСБ” (60%) и “ТИМ” (40%). По полу и факту курения группы между собой не отличались.

В табл. 2, 3 представлены различия по показателям липидного профиля среди пациентов разных групп, которые позволяют сделать вывод о том, что группа “Контроль” отличается от остальных групп: по показателям ОХС, ХС ЛНП, ТГ и ИА.

Концентрация ОХС в норме только у пациентов группы “Контроль”; в остальных группах у большинства она выше нормы. Уровень ХС ЛНП существенно выше нормативных показателей во всех группах, но доля тех, у кого ХС ЛНП в норме, наибольшая в группе “Контроль” (33%) и “ТИМ” (25%). Статистически значимых различий по концентрации и доли пациентов в группах по показателям ХС ЛВП и ТГ не обнаружено: ХС ЛВП и ТГ в норме у большинства пациентов. ИА выше нормы преимущественно у пациентов группы “Норма” (74%) и “АСБ” (67%).

В результате проведенного сравнения показателей СЭЕ в разных группах с принятыми за норму референтными значениями концентрации ЭТ и АТ-ЛПС (табл. 4) была выявлена статистически значимая разница по всем показателям для группы “АСБ”. Концентрация ЛПС у пациентов с наличием атеросклеротических бляшек в структуре стенки экстракраниального отдела БЦА была достоверно выше референтных значений принятой нормы (p < 0.001), а концентрация АТ-ЛПС-ФОБ достоверно снижена (p < 0.001). Среди пациентов группы “ТИМ” отмечается снижение концентрации АТ-ЛПС-ФОБ (p < 0.05). У обследованных из группы “Норма” отмечается повышение концентрации ЭТ (p < 0.05), при нормальном уровне активности АЭИ. Показатели СЭЕ у пациентов из группы “Контроль” схожи с таковыми из группы “ТИМ”: снижение концентрации АТ-ЛПС-ФОБ при нормальной концентрации ЭТ и АТ-ЛПС-ФИЛ.

В табл. 5 представлены различия по показателям СЭЕ между группами пациентов.

По концентрации ЭТ различаются группы “ТИМ” и “АСБ”: концентрация ЭТ в группе “АСБ” самая высокая, а самая низкая в группе “ТИМ”. Наибольшее число пациентов с ЭТ выше нормы также в группе “АСБ” (58%). Статистически значимых различий между группами по показателю АТ-ЛПС-ФИЛ не обнаружено. Максимальное число пациентов с уровнем АТ-ЛПС-ФОБ выше референтных значений отмечается в группе “Норма” (37%). Интересным представляется то, что число человек в группе “Норма” с повышенным уровнем ЭТ 33.3%, что близко к числу человек с увеличенным количеством АТ-ЛПС-ФИЛ. Практически аналогичную картину наблюдали в группе “Контроль”, где доля пациентов с нормальным уровнем ЛПС полностью совпадает с числом пациентов с концентрацией АТ-ЛПС-ФОБ ниже нормативных показателей (77.8 и 77.8% соответственно). Такое соответствие свидетельствует об отсутствии эндотоксиновой агрессии (ЭА) в группе “Контроль”: нет повышения концентрации ЭТ и снижения активности АЭИ. Похожие изменения в показателях СЭЕ были обнаружены и в группе “ТИМ”: низкие значения АТ-ЛПС-ФОБ при нормальном уровне ЭТ. Но группа “ТИМ” отличается от группы “Контроль” показателями липидного профиля. Хотя имеет место интересное соотношение: число тех, у кого ХС ЛНП превышают нормативные значения и число пациентов с нормальным уровнем ЭТ полностью совпадает (75 и 75%), также и с числом пациентов с повышенным уровнем ОХС и сниженным количеством АТ-ЛПС-ФОБ (65 и 65%). Эти крайне интересные факты косвенно подтверждают наличие общего для ЛПС и ОХС механизма транспорта [12, 27, 28], что побудило нас к проведению корреляционного анализа показателей СЭЕ и параметров липидного профиля.

На первом этапе проведения попарных корреляций нами было выявлено значительное влияние уровня ЭТ и соотношения АТ-ЛПС на значение ИА и концентрацию ОХС при построении линейной модели [29]. Однако при расширении выборки (с 80 до 113 чел.) в данном исследовании эти связи оказались близкими к нулю. Но при делении по половому признаку у мужчин была обнаружена положительная корреляция АТ-ЛПС-ФОБ с уровнем ОХС (r_s = 0.28, р < 0.05) и ХС ЛНП (r_s = 0.43, p < 0.01).

При проведении корреляционного анализа отдельно для каждой группы пациентов мы выявили, что у пациентов группы “ТИМ” определяется взаимосвязь концентрации АТ-ЛПС-ФОБ и ТГ (r_s = –0.52, p < 0.05): при увеличении концентрации АТ-ЛПС-ФОБ концентрация ТГ снижается. Влияния уровня ЭТ на концентрацию ХС ЛНП или ОХС ни в одной из групп отмечено не было. В группе “Норма” отмечается положительная корреляция концентрации АТ-ЛПС-ФИЛ (r_s = = 0.45, p < 0.05) и отношения АТ-ЛПС-ФИЛ/АТ-ЛПС-ФОБ (r_s = 0.44, p < 0.05) на уровень ХС ЛНП, и отрицательное влияние отношения АТ-ЛПС-ФИЛ/АТ-ЛПС-ФОБ на уровень ТГ (r_s = –0.44, p < 0.05). При построении множественной линейной регрессионной модели показателей липидного профиля выявлено, что концентрация ОХС увеличивается на 1.13 и 1.27 единиц при увеличении ХС ЛНП и ХС ЛВП на 1 единицу соответственно (r_s = 0.8633, p < 0.0001). При включении в модель ЭТ влияния на уровень ОХС не обнаружилось. Таким образом, выявленные нами взаимосвязи могут подтверждать общность транспортных механизмов ЛПС и ОХС за счет взаимодействия АТ-ЛПС и липопротеинов. Кроме того, на основании выявленных взаимосвязей, нам представляется важным изучение роли ЭТ и АТ-ЛПС в обмене ТГ, поскольку гипертриглицеридемия является независимым фактором риска развития атеросклероза [30], ассоциируется с развитием метаболического синдрома и ожирения. Последние два могут быть проявлением вялотекущего ЛПС-индуцированного воспаления.

Изучение взаимосвязи СЭЕ с липидным обменом является ключевым элементом познания тонких механизмов атерогенеза, о чем в определенной степени может свидетельствовать обнаруженная нами логарифмическая закономерность между показателями концентрации ЭТ, значениями ИА, уровнями ОХС и ХС ЛНП (рис. 1). Если рассматривать атеросклероз как динамическую модель в зависимости от выраженности ультразвуковых изменений стенки артерии, то последовательность событий можно представить следующим образом. Нормальная структура стенки при отсутствии дислипидемии и ЭА (группа “Контроль”). Далее, при возрастании уровня ЭТ, если считать его инициирующим фактором, наблюдается схожая кривая прироста ИА, концентрации ХС ЛНП и ОХС (группа “Норма”). Затем при прогрессировании атеросклероза отмечается утолщение и уплотнение стенки, на фоне которого регистрируется снижение концентрации ЛПС, нормализация ИА, уровня ХС ЛНП и ОХС (группа “ТИМ”) на фоне истощения АЭИ (как следствие перенесенной ЭА) (табл. 5), проявляющегося в снижении количества АТ-ЛПС-ФОБ с последующим исходом в формирование атеросклеротической бляшки при возрастании уровня ЭТ, сопровождаемое приростом ИА и повышением концентрации ХС ЛНП и ОХС.

Рис. 1.

Динамическая модель взаимосвязи ультразвуковых изменений структуры стенки артерии. Ось Х – группа по состоянию стенки (1 – группа “Контроль”, 2 – группа “Норма”, 3 – группа “ТИМ”, 4 – группа АСБ); ось Y – концентрация показателей (А – ЭТ, EU/мл, Б – ИА, В – ХС ЛНП, ммоль/л, Г – ОХС, ммоль/л).

Выявленные нами закономерности формы кривой дают возможность предположить более сложные механизмы влияния ЛПС на показатели липидного профиля, нежели прямые корреляции.

Изучение роли СЭЕ в прогрессировании атеросклероза невозможно без проведения статистического однофакторного анализа рисков попадания пациентов в группу по состоянию стенки. Статистическая значимость влияния факторов на целевое событие (группа по состоянию стенки) осуществлялась с помощью критерия Хи-квадрат Пирсона с включением количественных, бинарных и номинальных факторов. Все факторы сортировались по убыванию значимости (статистика Хи-квадрат), и таким образом были отобраны ключевые факторы развития события (попадание в соответствующую группу “ТИМ”, “АСБ” и объединенная группа “ТИМ + + АСБ”). В табл. 6 представлен список факторов, влияющих на попадание пациента в группу “ТИМ”.

На основании табл. 6 можно сделать вывод о том, что 9 из 14 факторов имеют статистическую значимость в распределении пациентов в группу “ТИМ” с диапазоном уровней рисков от 31.1 до 64.3%. При наличии данных факторов из списка риск пациента иметь утолщенный комплекс интима-медиа БЦА увеличиваются от 23.7 до 64.3%. Лидирующими факторами с повышением уровней рисков от 48.2 до 53.1% являются: “Холестерин < 5.9 ммоль/л”, “Возраст ≥ 52.0 лет” и “ХС ЛНП < 3.9 ммоль/л”. Статистически незначимыми факторами оказались: “Индекс атерогенности < 4.3”, “Индекс атерогенности (Норма)” и “Отношение АТ-ЛПС-ФИЛ/АТ-ЛПС-ФОБ ≥ 1.8”, которые повышают риск оказаться в группе “ТИМ” от 23.7 до 25.5%.

В табл. 7 представлен список факторов, влияющих на попадание пациента в группу “АСБ”.

На основании табл. 7 можно сделать вывод о том, что 12 из 14 факторов имеют статистическую значимость в распределении пациентов в группу “АСБ” с диапазоном уровней рисков от 21.4 до 51.3%. При наличии данных факторов из списка риск, что у пациента будет лоцирована одна и более атеросклеротическая бляшка в БЦА, увеличивается от 15.1 до 51.3%. Лидирующими факторами с повышением уровней рисков от 34.1 до 51.3% являются: “АТ-ЛПС-ФОБ < 163.0 у. е. о. п.”, “Возраст старше 55 лет” и “Возраст ≥ 52.0 лет”. Статистически незначимыми факторами оказались: “ХС ЛНП (Норма)" и "Пол (Женский)”, которые повышают уровень риска от 15.1 до 34.6%.

В табл. 8 представлен список факторов, которые влияют на развитие изменений стенки артерий, включающие утолщение и формирование атеросклеротической бляшки.

На основании табл. 8 можно сделать вывод о том, что 10 из 14 факторов имеют статистическую значимость в выявлении у пациентов нарушенной структуры стенки и атеросклеротической бляшки с диапазоном уровней рисков от 20.4 до 45.3%. Под воздействием влияния факторов из списка, риски попадания в объединенную группу “ТИМ + АСБ” увеличиваются от 11.5 до 45.3%. Лидирующими факторами с повышением уровней рисков от 30.3 до 45.3% являются: “АТ-ЛПС-ФОБ < 163.0 у. е. о. п.”, “Возраст старше 55 лет” и “Возраст ≥ 52.0 лет”. Статистически незначимые факторы: “ЭТ (Выше нормы)” и "Пол (Женский)”, которые повышают уровень риска от 11.5 до 13.9%.

Результаты проведенного исследования показали, что у пациентов со стойкими атеросклеротическими изменениями в виде формирования атеросклеротической бляшки (группа “АСБ”) имеет место хроническая ЭА. В сравнении с пациентами из других групп с начальными изменениями стенки артерий или только с биохимическими маркерами атеросклероза (нарушения липидного профиля), в группе “АСБ” отмечается повышение концентрации ЭТ и снижение концентрации АТ к обеим частям молекулы ЛПС. Среди пациентов с утолщенным комплексом интима-медиа и с нормальным строением стенки параметры СЭЕ имеют выборочные отклонения от референтных значений нормы. Интересным представляется выявленный нами факт схожих значений в концентрации ЭТ и АТ-ЛПС-ФОБ в группах “Контроль” и “ТИМ”. По показателям СЭЕ эти две группы не отличаются, но и по параметрам липидного профиля только уровень ОХС выше в группе “ТИМ”. Больший вклад в различия между пациентами вносит возраст обследуемых и наличие АГ. Эти показатели – признанные факторы риска атеросклероза. Также как и мужской пол, который является фактором риска и вносит свой вклад в выявление корреляций между показателями СЭЕ и параметрами липидного профиля. Необходимость внесения поправок на пол и группу по состоянию стенки, при выявлении взаимодействий между показателями СЭЕ и параметрами липидного профиля не дает возможность подтвердить, что показатели СЭЕ являются независимыми факторами риска развития атеросклероза.

При проведении многофакторного анализа с оценкой рисков фактор “Возраст” стоит на первом месте для всех групп пациентов, а далее ведущими факторами выступают АТ-ЛПС. Это может определять ни столько роль нарушения микробиоты и, соответственно, влияние концентрации ЭТ на атерогенез, сколько важность состояния АЭИ на прогрессирование болезней атеросклеротической природы. При нормальном уровне АТ-ЛПС, несмотря на наличие дислипидемии, не определяется нарушение структуры стенки БЦА (группа “Норма”). При снижении концентрации АТ-ЛПС отмечается сначала отек медии и нарушение трехслойной структуры стенки артерии (группа “ТИМ”), а в дальнейшем, при продолжающейся ЭА и отсутствии должного прироста количества АТ-ЛПС, это ведет к формированию атеросклеротической бляшки. Выявленные динамические изменения структуры стенки, при соотношении их с динамикой показателей липидного профиля и СЭЕ среди групп, дают основания предполагать возможную обратимость атеросклероза за счет влияния на показатели СЭЕ и снижения степени ЭА. Этот вопрос подлежит изучению. Выявленная нами зависимость концентрации ТГ и ХС ЛНП от концентрации АТ-ЛПС-ФОБ и отношения АТ-ЛПС также требует дальнейшего изучения на уровне клеточных моделей или в экспериментах на животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявленные нами достоверные различия параметров СЭЕ у пациентов без клинических проявлений атеросклероза подтверждают правомочность эндотоксиновой концепции атерогенеза [19] и дают возможность рассматривать хроническую ЭА как важный фактор риска развития и патогенеза заболеваний атеросклеротической природы. Избыток ЛПС в общем кровотоке при сниженной активности АЭИ (являющимися главными признаками наличия ЭА), позволяет использовать показатели СЭЕ в качестве прогностических маркеров течения атеросклеротического процесса.

Этические нормы. Все исследования проведены в соответствии с принципами биомедицинской этики, сформулированными в Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующих обновлениях, и одобрены локальным биоэтическим комитетом Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии (Москва).

Информированное согласие. Каждый участник исследования представил добровольное письменное информированное согласие, подписанное им после разъяснения ему потенциальных рисков и преимуществ, а также характера предстоящего исследования.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.