Физиология человека, 2019, T. 45, № 6, стр. 124-132

МЕТОДИКА

В исследовании принимали участие здоровые испытуемые мужского пола в возрасте 18–21 г., которых разделили на две группы: контрольную (n = 20) и опытную (n = 20). Испытуемые принимали препарат “Вита-мелатонин” по 3 мг 1 раз в сутки за 30 мин до сна в течение 2-х мес. В контрольной группе по аналогичной схеме получали плацебо (глюкоза). У обследуемых во второй половине дня (с 8 до 10 ч) проводили забор 8.0 мл крови из кубитальной вены до и после субмаксимальной ФН в начале и после приема курса мелатонина. Выполняли тест PWC₁₇₀ на велотренажере в объеме двух нагрузок по 5 мин с интервалом между ними 3 мин и частотой педалирования 60 об./мин [7]. Исследования проведили в двухмесячный период, середина которого приходилась на весеннее равноденствие.

Показатели кислородтранспортной функции крови измеряли с помощью микрогазоанализатора “Syntesis-15” фирмы “Instrumentation Laboratory”: парциальное напряжение кислорода в крови (pO₂), степень оксигенации (SO₂), парциальное напряжение углекислого газа (рСО₂) и рН крови. Кислотно-основное состояние крови определяли по номограммам Siggaard-Andersen по следующим показателям: концентрация бикарбоната плазмы $\left( {{\text{НСО}}_{3}^{ - }} \right);$ концентрация общей углекислоты плазмы (ТСО₂); действительный и стандартный недостаток/избыток буферных оснований (АВЕ/SBE). СГК определяли спектрофотометрически по показателю р50 (pO₂ крови при 50% насыщении ее кислородом). р50_станд измеряли при стандартных условиях (рН = 7.4; рСО₂ = 40 мм рт. ст. и Т = = 37°С), а р50_реальн – рассчитывали для реальных значений этих факторов по формуле J.W. Severinghaus [8].

Содержание конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов оценивали по интенсивности УФ-поглощения при длине волны 233 нм на спектрофотометре “Солар” СМ 2203 [9]. Содержание малонового диальдегида (МДА) в плазме крови и эритроцитах определяли по интенсивности окраски комплекса розового цвета, образованного в реакции с 2'-тиобарбитуровой кислотой, на “Solar” PV1251C при длине волны 535 нм [10]. Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах определяли спектрофотометрически по модифицированному методу J. Sedlak и R. Lindsay, основанного на реакции взаимодействия SH-групп глутатиона с 5.5'-дитиобис (2-нитробензойной кислотой), которая способна поглощать свет при длине волны 412 нм [11]. Содержание α-токоферола и ретинола измеряли по интенсивности флуоресценции гексанового экстракта при длине волны возбуждения 286 нм и испускания 330 нм (для α-токоферола) и при длине волны возбуждения 325 нм и испускания 470 нм (для ретинола) [12]. В качестве стандарта использовали α-токоферол и ретинол фирмы “Sigma”. Уровень церулоплазмина определяли методом Равина, который основан на окислении p-фенилендиамина при участии церулоплазмина. Интенсивность окраски оценивали спектрофотометрически при длине волны 530 нм [13]. Активность каталазы в эритроцитарной массе регистрировали по количеству окрашенного продукта в реакции перекиси водорода с солями молибдена, который фотометрировали при длине волны 410 нм на “Solar” PV1251C [14].

Продукцию NO определяли по суммарному содержанию нитрат/нитритов (NO_х) в плазме крови с использованием реактива Грисса на спектрофотометре при длине волны 540 нм [15]. Уровень эндогенного сероводорода измеряли спектрофотометрическим методом, основанном на реакции между сульфид-анионом и кислым раствором реактива N.N-диметил-парафенилендиамина солянокислого при длине волны 670 нм [16].

Статистическую обработку цифровых данных производили с использованием программы Statistica 6.0. Нормальность распределения полученных результатов оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Данные, имеющие нормальное распределение, представлены в виде: среднее значение ± среднее квадратическое отклонение, при этом для определения статистической значимости различий использовался t-критерий Стьюдента для зависимых выборок. Данные, имеющие распределение, отличающееся от нормального, представлены в виде: медиана (25 процентиль – 75 процентиль); в этом случае для определения статистической значимости различий использовали критерий парных сравнений Вилкоксона. Результаты считали статистически значимыми при значении р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные состояния кислородтранспортной функции крови у лиц контрольной группы представлены в табл. 1. Выполнение субмаксимальной ФН лицами контрольной группы обусловливает изменения газотранспортной функции крови. Так, у обследуемых наблюдается изменение кислотно-основного состояния крови (рН уменьшается на 1.1% (р < 0.01)), отмечается уменьшение рСО₂ на 7.5% (p < 0.01). Также выявлено повышение pO₂ в крови на 29.5% (р < 0.01), SO₂ – на 44.4% (р < 0.01). Величина значений р50 при реальных значениях рН, pCO₂ и температуры крови возрастает на 5.5% (р < 0.01). Через 2 мес. наблюдается сходный характер изменений параметров кислородтранспортной функции крови.

В табл. 2 представлены данные, отражающие состояние кислородтранспортной функции крови у лиц опытной группы. После субмаксимальной ФН в начале исследования выявлено повышение рО₂ на 30.2% (р < 0.001), SO₂ на 46.1% (р < < 0.01), что сопоставимо с характером изменений у лиц контрольной группы. При этом так же отмечается рост значения p50_реал (на 6.3%, р < 0.01), что отражает сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина при реальных условиях циркуляции вправо (рис. 1). Достоверных различий в опытной и контрольной группах до и после ФН не выявлено. После приема мелатонина при субмаксимальной ФН наблюдается увеличение рО₂ на 7.7% (р < 0.005), SO₂ на 28.9% (р < 0.03). Величина значений р50 при реальных значениях рН, рСО₂ в крови и температуры при этом вырастает на 10.5% (р < 0.01), что отражает больший сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина при реальных условиях циркуляции вправо (рис. 1). Из рис. 1 видно, что параметры кислородтранспортной функции крови у лиц опытной группы после окончания курса приема мелатонина характеризуются менее значительными изменениями величин рО₂, SО₂ и большим ростом p50_реал в сравнении как с исходными значениями, так и за аналогичный период у контрольной группы. Так же следует обратить внимание, что p50_реал был выше и до ФН после приема мелатонина.

Рис. 1.

Кривые диссоциации оксигемоглобина при реальных значениях рН, pСО₂ и температуры до (а) и после физической нагрузки в начале (б) и в конце (в) курса приема мелатонина. По оси ординат – насыщение крови кислородом, %. По оси абсцисс – парциальное напряжение кислорода в венозной крови, мм рт. ст.

Данные об активности процессов перекисного окисления липидов и состоянии антиоксидантной системы у лиц контрольной группы представлены в табл. 3. Установлено у данных лиц при ФН увеличение уровня МДА и диеновых коньюгатов (ДК) как в эритроцитах на 45.4% (р < 0.001) и 31.6% (р < 0.01), так и в плазме крови 43.2% (р < 0.001) и 47.4% (р < 0.011) соответственно. Одновременно с повышением активности свободнорадикальных процессов при ФН наблюдается снижение в эритроцитах концентрации восстановленного глутатиона на 20.8% (р < 0.01) и увеличение активности каталазы на 4.3% (р < 0.04). В плазме крови выявлено уменьшение концентрации α-токоферола на 25.1% (р < 0.01), ретинола на 43.6% (р < 0.01) и увеличение концентрации церулоплазмина на 12.3% (р < 0.01). Через 2 мес. отмечается подобная же степень прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса.

В табл. 4 представлены данные, отражающие эффект приема мелатонина на состояние прооксидантно-антиоксидантного равновесия до и после ФН. В начале исследования установлено увеличение уровня МДА и ДК в эритроцитах – на 42.8% (р < 0.001) и 30.5% (р < 0.004), в плазме крови – на 45.3% (р < 0.001) и 43.1% (р < 0.001) соответственно. Также наблюдается снижение в эритроцитах концентрации восстановленного глутатиона на 21.8% (р < 0.024) и увеличение активности каталазы на 6.4% (р < 0.01). В плазме крови выявлено снижение концентрации α-токоферола на 24.4% (р < 0.002), ретинола на 49.1% (р < 0.001) и увеличение уровня церулоплазмина на 9.6% (р < 0.001). Достоверных различий в опытной и контрольной группах как до, так и после ФН не выявлено. После проведенного курса приема мелатонина наблюдается менее значительное увеличение уровня МДА и ДК в эритроцитах – на 25.6% (р < 0.001) и 21.5% (р < 0.002), в плазме крови – на 19.9% (р < 0.001) и 26.7% (р < < 0.001) соответственно. Снижение в эритроцитах концентрации восстановленного глутатиона (на 14.5%, р < 0.002) менее выражено чем в исходных данных, как и увеличение активности каталазы (на 12.5%, р < 0.01). В плазме крови выявлено снижение концентрации α-токоферола на 14.6% (р < 0.002), ретинола на 29.1% (р < 0.001) и увеличение уровня церулоплазмина на 24.7% (р < 0.001). Прием мелатонина обусловливает менее существенный прирост уровня МДА, ДК и меньшее снижение концентрации ретинола, α-токоферола и восстановленного глутатиона, чем во время первого исследования, а так же и в сравнении с значениями за аналогичный период контрольной группы, что свидетельствует о снижении степени прооксидантно-антиоксидантного дисбаланса после ФН.

Процессы адаптации организма к ФН различного характера связаны с изменениями нервной и гуморальной регуляции, адекватной перестройкой центральной и периферической гемодинамики [17]. Снижение СГК у обследуемых с ФН в наших опытах следует расценивать как компенсаторную реакцию на недостаточность функционирования механизмов, обеспечивающих поступление кислорода в ткани. Сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина вправо (снижение СГК), способствует лучшей деоксигенации крови и, очевидно, оптимизации кислородного режима тканей [18], отражает снижение нагрузки на системы кровообращения и дыхания. Так, пребывание добровольцев в условиях подобных Эвересту (рО₂ – 282 мм рт. ст.) в течение 42 сут увеличивало значение р50_станд с 28.2 до 33.1 мм рт. ст., что приводит к росту экстракции О₂ на 7.9% [19].

Функциональная гипоксия при ФН вызывает усиление адаптивных процессов, возникновение на уровне кислородтранспортной функции крови компенсаторной реакции, проявляющейся во включении регуляторных резервов, увеличивающих доставку кислорода к тканям. Одним из таких факторов может быть мелатонин. Его эффект на кислородзависимые процессы может быть связан не только с прямым действием (воздействие на специфические рецепторы), но и с опосредованным влиянием (через кислородтранспортную функцию крови, прооксидантно-антиоксидантый баланс) [6]. Гормон эпифиза, с одной стороны, проявляет прямые антиоксидантные свойства, выступая в роли “ловушки” свободных радикалов, подавляя активность процессов ПОЛ [4], а с другой – оказывает эффект на СГК. Как известно, введение мелатонина в течение четырех суток перед холодовым воздействием и последующим отогреванием приводит к улучшению механизмов транспорта кислорода в ткани, смещению кривой диссоциации оксигемоглобина вправо [6]. Посредством мелатонина можно регулировать кислородсвязывающие свойства крови, влияя на процессы транспорта кислорода, тем самым, благоприятствуя процессам тканевой оксигенации и эффективности функционирования антиоксидантной системы, и в конечном итоге, всей организации поддержания прооксидантно-антиоксидантного равновесия в организме.

Также у лиц контрольной группы было определено, что выполнение ФН приводит к повышению концентрации газотрансмиттеров в плазме крови – монооксида азота (рис. 2) на 54.1% (р < < 0.001), сероводорода (рис. 3) на 32.8% (р < < 0.001), а проведение курса приема мелатонина способствует более высокой концентрации газотрансмиттеров в плазме крови при ФН – монооксида азота на 74.9% (р < 0.001), сероводорода на 46.5% (р < 0.001).

Рис. 2.

Уровень нитрат/нитритов до (а) и после (б) физической нагрузки в начале и в конце курса приема мелатонина. По оси ординат – концентрация, мкмоль/л. По оси абсцисс – исходные (А) и значения через 2 мес. (Б) контрольной группы, начало (В) и после курса (Г) приема мелатонина. * – различия статистически значимы до нагрузки (р < 0.05); # – к исходным значениям (р < 0.05).

Рис. 3.

Уровень сероводорода до (а) и после (б) физической нагрузки в начале и в конце курса приема мелатонина. Обозначения см. рис. 2.

Газотрансмиттеры играют важную роль в сложном комплексе взаимосвязанных процессов, определяющих доставку кислорода, его экстракцию и утилизацию в различные ткани организма. Монооксид азота и сероводород, относящиеся к классу газотрансмиттеров, участвуют в формировании кислородного режима и кислородтранспортной функции крови. ФН оказывает системное воздействие на организм, что во многом опосредовано ростом продукции газотрансмиттеров, так как эти молекулы вовлечены в межклеточную коммуникацию и выполняют разнообразные функции [20]. У данных обследуемых при выполнении ФН наблюдаются более высокие значения концентрации общих нитратов и сероводорода. Эти факторы участвуют в адаптивных изменениях кислородтранспортной функции крови при ФН. Эндотелий как источник NO влияет на образование H₂S. Также в эритроцитах отмечается достаточно высокая продукция Н₂S [21], который может непосредственно связываться с гемоглобином, образуя сульфогемоглобин, изменяя положение кривой диссоциации оксигемоглобина.

Согласно нашим исследованиям, эффект мелатонина обеспечивает усиление антиоксидантной защиты путем активации системы газотрансмиттеров, а именно монооксида азота и сероводорода. Кроме того, газотрансмиттеры вносят вклад в формирование СГК через различные механизмы: образование различных дериватов гемоглобина (нитрозогемоглобин, нитрозилгемоглобин, метгемоглобин, сульфогемоглобин), модулирование внутриэритроцитарной системы формирования кислородсвязывающих свойств крови, а также опосредовано через системные механизмы [18], что может способствовать усилению согласованности функционирования антиоксидантной системы, уменьшая прооксидантно-антиоксидантный дисбаланс и развитие окислительного стресса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, мелатонин обеспечивает больший сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина вправо после выполнения физических упражнений, что улучшает доставку кислорода к тканям и его использование, а также прооксидантно-антиоксидантное состояние. Выявленный рост уровня газотрансмиттеров (монооксид азота и сероводород) после приема мелатонина имеет значение для формирования кислородтранспортной функции крови и поддержания прооксидантно-антиоксидантного баланса организма при ФН.

Этические нормы. Все исследования проведены в соответствии с принципами биомедицинской этики, сформулированными в Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующих обновлениях, и одобрены локальным биоэтическим комитетом учреждения образования Гродненского государственного медицинского университета (Гродно, Беларусь).

Информированное согласие. Каждый участник исследования представил добровольное письменное информированное согласие, подписанное им после разъяснения ему потенциальных рисков и преимуществ, а также характера предстоящего исследования.

Финансирование работы. Данная работа проводилась за счет средств проекта № регистрации 20 170 643.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам научно-исследовательской группы по изучению газотранспортной функции крови научно-исследовательской части учреждения образования “Гродненский государственный медицинский университет”.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.