Физиология человека, 2023, T. 49, № 1, стр. 104-115

МЕТОДИКА

В исследовании принимали участие 8 практически здоровых мужчин без выявленных острых и хронических заболеваний, из которых 7 выполнили программу в полном объеме. Средний возраст (± стандартное отклонение) участников составил 35.6 ± 6.6 лет, рост 179.9 ± 4 см, вес 77.6 ± ± 9.6 кг. С целью соблюдения принципа конфиденциальности экспериментальных данных добровольцам были присвоены произвольные номера.

Дизайн исследования. Эксперимент “Арфа 20” проводили в ГНЦ РФ – Институте медико-биологических проблем РАН (г. Москва). Исследование, выполненное методом рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого исследования (в группе плацебо и группе ГМУ участвовали одни и те же испытуемые), являлось аналогом рандомизированного клинического исследования (РКИ). Фактор воздействия – нахождение в условиях гипомагнитной среды, создаваемой в установке “Арфа”. В ограниченном объеме установки создавалось снижение естественного магнитного поля с помощью системы обмоток с током (колец Гельмгольца), т.е. методом компенсации естественного магнитного поля Земли системой колец, суммарный вектор магнитного поля которых направлен в противоположном направлении геомагнитного поля. Кратность ослабления магнитного поля представлена по сессиям в табл. 1.

Описание исследования. На подготовительном этапе предполагали 4-часовую тренировочную экспозицию для адаптации добровольца к неизвестным ему условиям работы в установке “Арфа”, методикам экспериментальной программы, гипокинезии. Проводили предварительное обучение методикам.

1-я серия эксперимента: 24-часовое исследование в ГМУ.

Началу серии предшествовали фоновые исследования. 1 сессия – 8-часовое пребывание испытуемого в установке (утро-день), далее следует 3-часовой контролируемый перерыв, 2 сессия – испытуемого помещали в установку на 8 ч (ночное время), далее следует 3-часовой контролируемый перерыв, 3 сессия – испытуемого помещали в установку на 8 ч (дневное время), далее следует 3-часовое исследование последействия.

2-я серия эксперимента: 24-часовое исследование в условиях плацебо. Организовывали по аналогичной 1-й серии схеме без воздействия гипомагнитного фактора.

Серии эксперимента рандомизировали, минимальное время между сериями составляло не менее 7 сут.

Условия. По условиям эксперимента до его начала испытуемый проходил рутинный медицинский контроль (сбор анамнеза, контроль АД и физикальный осмотр), предэкспозиционное исследование, перед размещением испытуемого в установке предлагали сходить в туалет. При размещении внутри установки ограничивали движения испытуемого, каждые полтора часа проводили разминку (сидя), испытуемым во время незанятости методиками исследования разрешали читать, рисовать, смотреть фильм (по циклограмме). Туалет внутри установки осуществлялся в мужскую “утку”, питьевой режим был установлен в равномерном объеме 100 мл/ч нахождения (по требованию). Питание испытуемого обеспечивали в размере 1800 ккал в сутки в рамках гигиенического требования без учета физической активной работы (она невозможна во время исследований). За испытуемыми осуществляли постоянный контроль медицинский персонал. После экспозиционного исследования осуществляли рутинный медицинский контроль и на утро следующего дня осуществляли телемедицинский контроль (исследование АД, сбор анамнеза).

Сбор сухих пятен крови. Анализировали образцы сухих пятен капиллярной крови, собранной у добровольцев в двух сессиях эксперимента: с ГМУ, когда гипомагнитная установка была включена, и “плацебо”, когда установка была выключена. В каждой сессии пробы капиллярной крови отбирали до первой экспозиции, как можно ближе по времени к окончанию первой 8-часовой экспозиции, аналогично после второй и третьей экспозиций. Использовали метод двойного слепого контроля (ни испытуемый, ни экспериментатор не знали, включена ли гипомагнитная установка). Таким образом, в сессии “плацебо”, когда гипомагнитная установка была выключена, действовали все сопутствующие условия (гиподинамия, стресс, характер питания и др.), кроме ГМУ, и образцы сухих пятен крови собирали по аналогичной схеме.

Методика отбора пятен и их подготовка к хромато-масс-спектрометрическому анализу. Капиллярную кровь получали путем прокола фаланги безымянного пальца с помощью автоматического индивидуального скарификатора. Каплю крови помещали на специальную фильтровальную бумагу. После сбора пятна крови сушили на фильтрах при температуре окружающей среды (от 19 до 26°C) в течение 2–3 ч с минимальным воздействием солнечного света, а затем помещали в пакет с застежкой-молнией. Фильтры хранили при температуре –20°C перед дальнейшей подготовкой образцов для анализа LC – MS/MS. Высушенное пятно крови вырезали и помещали в полипропиленовую пробирку Эппендорфа на 1.5 мл. Белки экстрагировали в 1 мл раствора 25 мМ бикарбоната аммония, 1% дезоксихолата натрия и 5 мМ TCEP (трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид) (Thermo Fisher Scientific, США) при 60°C со встряхиванием при 1000 об./мин (ThermoMixer, Eppendorf, Германия) в течение одного часа.

Стандартный метод подготовки проб [17] включал восстановление 0.1 М дитиотреитолом в 0.1 М трис-буфере (pH 8.5), содержащем 8 М мочевину, в течение 30 мин при 47°C, а также алкилирование 0.05 М йодацетатом и инкубацию в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. Затем проводили осаждение 5 объемами ацетона в присутствии 0.1% TFA при –20°C в течение ночи. После осаждения белков, осадок отмывали ацетоном, затем 96% спиртом. Процедуру подготовки образца завершали трипсинолизом в 0.05 М аммоний бикарбонатном буфере. К осажденной смеси белков добавляли 100 мкл буфера и 2 мкл раствора трипсина в концентрации 1 мкг/мкл в 50 мМ уксусной кислоте. Инкубацию проводили в течение ночи в термомиксере при 37°C со встряхиванием при 750 об./мин. Затем добавляли 1 мкл 10% водного раствора муравьиной кислоты для инактивации трипсина и осаждения дезоксихолата натрия. Образец центрифугировали при 21 000 g в течение 10 мин и 20 мкл супернатанта переносили в новую пробирку. На этом этапе образец был готов для масс-спектрометрического анализа.

Хромато-масс-спектрометрический анализ. Полученную смесь триптических пептидов анализировали методом жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии на основе системы нано-ВЭЖХ Dionex Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, США) и масс-спектрометра TimsTOF Pro (Bruker Daltonics, США). Для разделения пептидов использовали колонку (C18, 25 см × 75 мкм 1.6 мкм) (Ion Optics, Австралия). Скорость потока составляла 400 нл/мин. Градиентное элюирование от 4 до 90% фазы B проводили в течение 40 мин. Подвижная фаза A состояла из 0.1% муравьиной кислоты в воде, а подвижная фаза B состояла из 0.1% муравьиной кислоты в ацетонитриле. Источник ионизации электрораспылением (ESI) работал при капиллярном напряжении 4500 В. Измерения проводили в диапазоне m/z от 100 до 1700. Масс-спектрометрический анализ выполняли с использованием метода сбора данных с параллельным накоплением – последовательной фрагментацией (PASEF).

Полученные данные были проанализированы с использованием PEAKS Studio 8.5 и MaxQuant версии 1.6.7.0 со следующими параметрами: максимальная погрешность определения исходного иона –20 ppm; максимальная погрешность массы фрагментов –0.03 Да; фермент – трипсин; максимальное число пропущенных связей – 3; фиксированные модификации – Карбамидометил (C); возможные модификации – Окисление (М), Ацетилирование (N-конец). Идентификацию белков по выявленным пептидам проводили с использованием базы данных SwissProt, с установленным уровнем FDR в 0.01 (FDR – уровень ложно-положительного открытия). По интенсивности пиков фрагментов судили о содержании белков. Для выявления достоверных различий использовали дисперсионный анализ и апостериорный анализ Тьюки HSD (p-value 0.05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При масс-спектрометрическом анализе образцов, восстановленных из “сухих” пятен крови, было идентифицировано 7854 пептида (FDR 1%), по которым было идентифицировано 1219 различных белков. В каждом образце было выявлено от 649 до 911 белков, причем проведение сессий эксперимента с ГМУ и без ГМУ не влияло на число полуколичественно определенных белков (рис. 1).

Рис. 1.

Количество белков, идентифицированных в сухих пятнах крови полуколичественным методом. Фоном служат точки до воздействий в обеих сессиях эксперимента. ГМУ – гипомагнитные условия.

Выявлено, что каждое последовательное включение установки, генерирующей ГМУ, не влияло на изменение числа идентифицированных белков в образцах (рис. 2). На рис. 2 представлена динамика изменения общего количества идентифицированных белков в образцах каждого испытуемого внутри каждой сессии: до включения установки, после первого включения, после второго и третьего. Однако ГМУ не привели к возникновению схожего паттерна изменения количества белков у испытуемых, т.е. количество идентифицированных белков изменялось в случайном порядке (закономерность не выявлялась).

Рис. 2.

Динамика количества идентифицированных белков в образцах сухих пятен крови испытателей № 1, 2, 3, 4 в сессиях с гипомагнитными условиями (ГМУ) и плацебо. а – до воздействий, б – после 1 воздействия, в – после 2 воздействия, г – после 3 воздействия.

Сравнительный анализ содержания белков в сухих пятнах крови в зависимости от числа воздействий был проведен как в сессиях с ГМУ, так и для сессий с плацебо. В результате анализа было выявлено, что все 3 последовательных воздействия ГМУ не отличались от эффекта плацебо в соответствующей контрольной сессии, тем не менее, следует рассмотреть результаты подробнее. С помощью дисперсионного анализа ANOVA, выполненного в программе Статистика 12, выявлено изменение содержания 13 белков в различных точках эксперимента в сессии плацебо. Проверку апостериорным анализом (Tukey HSD test) прошли лишь 4 белка (табл. 2). Данные белки, очевидно, изменялись в зависимости от факторов, не связанных с ГМУ (циркадных ритмов, времени приема пищи, относительной гиподинамии во время экспозиции, эмоциональной напряженности и других). В дальнейшем, эти белки исключались из анализа воздействия ГМУ на белковый состав крови, поскольку даже при возможном обнаружении их достоверных различий в сессии с ГМУ, мы могли бы трактовать эти изменения как вызванные не гипомагнитными условиями, а сопутствующими условиями.

На втором этапе исследования дисперсионный анализ применяли для сравнения содержания белков в различных точках эксперимента в сессиях с ГМУ. Было выявлено 14 белков, меняющихся в различных точках воздействия ГМУ. Проведение апостериорного анализа (Tukey HSD test) подтвердило изменения, относительно фоновой точки (до воздействия ГМУ) трех белков: TPM3_HUMAN, ABHEB_HUMAN, CUTA_HUMAN. По данным апостериорного анализа (табл. 3) вышеперечисленные белки достоверно отличались от фоновых значений сессии с ГМУ только после третьего восьмичасового воздействия ГМУ.

Биологическую роль вышеуказанных белков стоит рассмотреть более подробно. Белок A-BHEB_HUMAN (белок 14B, содержащий абгидролазный домен) (рис. 3) является серингидролазой с неустановленной функцией в процессах метаболизма [18]. Предполагается, что ABHD14B играет роль в активации транскрипции, учитывая его взаимодействия с важными факторами транскрипции. Кроме того, данный фермент способен переносить ацетильную группу от посттрансляционно ацетилированного лизина к коферменту A (CoA) с образованием ацетил-CoA. Белок является, в основном, цитоплазматическим с широкой экспрессией во многих тканях организма. Однако, несмотря на эти исследования, эндогенные субстраты и биологические пути, которыми ABHD14B управляет in vivo, остаются не выясненными. Уменьшение вариабельности уровня данного белка в сессии с воздействием ГМУ отчетливо свидетельствует о принадлежности данного эффекта экспериментальным условиям.

Рис. 3.

Динамика содержания белка 14B, содержащего абгидролазный домен, (ABHEB_HUMAN) в двух сессиях эксперимента. * – достоверные изменения; – среднее значение, – среднее значение ± стандартная ошибка, – среднее значение ± 1.96 × стандартная ошибка. Остальные обозначения см. рис. 2.

Белок CUTA_HUMAN (белок, ассоциированный с ацетилхолинэстеразой) (рис. 4) способен связывать ионы меди и является, в основном, белком внеклеточных экзосом. CutA – это тримерный белок, гомологичный бактериальному белку CutA1, который принадлежит к оперону, участвующему в обеспечении устойчивости к двухвалентным металлам [19]. У человека экспрессия белка СutA повсеместна, причем самый высокий уровень белка отмечен в головном мозге, где CutA вовлечен в транспортировку и закрепление на мембране ацетилхолинэстеразы, хотя и не через прямое взаимодействие с этим ключевым ферментом процессинга нейротрансмиттера [20]. Кроме того, изоформа белка CutA, закрепленная на мембране, взаимодействует с мембраносвязанной β-секретазой BACE1, которая продуцирует нейротоксический пептид β-амилоида (βA), играющий ключевую роль в развитии болезни Альцгеймера [21]. Показано, что нокдаун или сверхэкспрессия CutA влияют в противоположных направлениях на секрецию βA в клеточной системе in vitro [21]. Важно отметить, что при исследовании эффекта ГМУ на белковый состав капиллярной крови, уровень данного белка имел тенденцию к повышению с каждым воздействием ГМУ, и достоверно был выше фонового уровня после третьего воздействия ГМУ (рис. 4), что потенциально может иметь негативный эффект на функции ЦНС.

Рис. 4.

Динамика содержания белка, ассоциированного с ацетилхолинэстеразой, (CUTA_HUMAN) в двух сессиях эксперимента. Обозначения см. рис. 2 и 3.

Также было показано увеличение концентрации ионов меди в сыворотке при воздействии ГМУ в течение 48 ч [13], что указывает на чувствительность связывания ионов меди с белками сыворотки и/или транспорта через клеточные мембраны в гипомагнитной среде. Результаты данной работы могут иметь значение для нашего исследования, так как белок CutA является внеклеточным белком, способным обезвреживать двухвалентные ионы, в том числе ионы меди. Увеличение уровня данного белка в крови могло быть компенсаторной реакцией на возможное изменение концентрации меди.

Белок TPM3_HUMAN (альфа-3 цепь тропомиозина), уровень которого снижался в ГМУ (рис. 5), принадлежит к семейству актин-связывающих белков, которое широко распространено в клетках и в основном участвует в клеточных сократительных процессах. В немышечных клетках тропомиозины участвуют в стабилизации актиновых филаментов цитоскелета. В скелетных мышцах тропомиозины участвуют в сокращении миофибрилл, модулируя взаимодействия между актином и миозином с участием тропомиозина [22]; в гладких мышцах регулируют сокращение гладких мышц, взаимодействуя с кальдесмоном. Тропомиозины имеют множество изоформ, экспрессируемых с четырех генов: TPM1, TPM2, TPM3 и TPM4. В саркомерах поперечно-полосатых мышц изоформы Tpm1.1, Tpm1.2, Tpm2.2 и Tpm3.12 образуют комплекс с тропонином, который регулирует двигательную активность миозина сердечных и скелетных мышц Са2-зависимым образом. В гладкомышечных клетках Tpm1.3, Tpm1.4 и Tpm2.1 играют более модулирующую роль в регулировании сокращения. Цитоскелетные тропомиозины (Tpm1,7, Tpm1,8, Tpm1,12, Tpm3,1 и Tpm4,2) представляют собой самую большую группу изоформ тропомиозина. Было показано, что они критически влияют на широкий спектр актомиозин-зависимых процессов, включая события эндо- и экзоцитоза, миграцию клеток, цитокинез, деление ядра, рост и эмбриогенез [23, 24].

Рис. 5.

Динамика содержания альфа-3 цепи тропомиозина (TPM3_HUMAN) в двух сессиях эксперимента. Обозначения см. рис. 2 и 3.

Показано [25], что ГМУ репрессируют экспрессию генов, связанных с миграцией клеток и сборкой цитоскелета, снижают концентрацию F-актина в клетках нейробластомы человека. Эти данные привели к предположению о влиянии ГМУ на различные процессы, связанные с подвижностью клетки и другие, посредством воздействия на F-актин, через который и проявляются неспецифические эффекты ГМУ [25]. По-видимому, тропомиозины также могут быть задействованы в ответе организма на ГМУ.

Однако при сравнении данных по содержанию вышеупомянутых белков с их содержанием в сессии “плацебо”, нам не удалось выявить значимых различий (рис. 3–5). Только уровень белка CutA после третьего воздействия ГМУ слегка поднимался выше средних значений в сессии “плацебо”. Стоит отметить, что фоновые уровни белков ABHEB_HUMAN и TPM3_HUMAN существенно отличались в сессиях ГМУ и плацебо, вероятно, потому, что существует продольная вариабельность содержания белков в крови, которая проявилась при исследовании у одних и тех же лиц через интервал времени между сессиями эксперимента. Перерыв между сессиями с ГМУ или плацебо составлял 2–3 нед., за который могло произойти изменение уровня белка под влиянием условий жизнедеятельности добровольцев (диеты, двигательной активности). Поэтому, несмотря на отсутствие отличий в содержании белков в сессии с ГМУ относительно сессии плацебо, некоторое влияние условий ГМУ на уровень белков крови могло присутствовать, т.к. самым рациональным в условиях существования фактора продольной вариабельности содержания белков является сравнение экспериментальных точек с наиболее близкой по времени точкой эксперимента, которой являлась индивидуальная фоновая точка сессии ГМУ.

На Земле или на пути к Международной космической станции люди защищены от большей части космического излучения магнитосферой Земли. Однако астронавты, которые будут совершать более длительные полеты за пределы низкой орбиты Земли, где сила геомагнитного поля незначительна, подвергаются большему риску. Действительно, были предложены инновационные инженерные конструкции, которые формируют большие электромагнитные поля вокруг корабля или около-планетной (на-планетной) базы, обычно через сверхпроводящие соленоиды, чтобы имитировать защиту магнитосферы Земли [26]. Кроме того, наземные исследования ГМУ также выявили изменения в структуре и функции ЦНС, эмбриональном развитии, синхронизации высвобождения гормонов и циркадном ритме различных функций у животных [2, 5, 10]. В литературных источниках отражены противоречивые результаты наблюдений, которые могут возникать из-за различия параметров магнитного поля и характеристик объекта исследования [27]. Это подразумевает необходимость дополнительных исследований с большим числом наблюдений, чтобы лучше понять возможные риски во время путешествий за пределы земной орбиты в дальний Космос.

Поэтому для развития исследований данного направления необходимо увеличить выборку испытуемых, а также увеличить время экспозиции в ГМУ, для получения значимых результатов.

Следовательно, необходимо углубленное изучение, на уровне протеомики крови, процессов регуляции гомеостаза для оценки возможных рисков воздействия ГМУ на здоровье человека, которые могут потенцировать негативные эффекты других космических факторов, таких, как радиация и микрогравитация.

ВЫВОДЫ

1. В образцах сухих пятен крови добровольцев, участвующих в эксперименте с ГМУ, полуколичественно определено 1219 различных белков.

2. Проведение сессий эксперимента с ГМУ и без включения гипомагнитной установки не влияло на число полуколичественно определенных белков в пятнах крови участников.

3. Дисперсионный анализ с апостериорной проверкой (Tukey HSD test) выявил изменения уровня трех белков: цепи тропомиозина альфа-3 (TPM3), белка 14В, содержащего домен абгидролазы (ABHD14B) и белка, ассоциированного с ацетилхолинэстеразой (CUTA), под влиянием ГМУ относительно фоновой точки, но не относительно соответствующего плацебо.

4. Сравнение данных, полученных у тех же самых участников в сессии “плацебо” и сессии с включением установки, не выявило достоверных изменений в уровнях вышеупомянутых белков.

5. Полученные результаты могут означать отсутствие эффекта, на уровне протеома крови, 24-часовые экспозиции здорового человека в ГМУ, либо слабый эффект, который маскирует естественная “продольная” вариабельность протеома крови.

Этические нормы. Все исследования проведены в соответствии с принципами биомедицинской этики, сформулированными в Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующих обновлениях и одобрены биоэтической комиссией Института медико-биологических проблем РАН (Москва) (протоколы № 542 от 11 мая 2020 г.).

Информированное согласие. Каждый участник исследования представил добровольное письменное информированное согласие, подписанное им после разъяснения ему потенциальных рисков и преимуществ, а также характера предстоящего исследования.

Финансирование работы. Работа была выполнена в рамках базовой тематики РАН 65.3. Работа по протеомному анализу проб сухих пятен крови выполнена частично при поддержке Мегагранта Министерства науки и высшего образования РФ (Соглашение со Сколковским институтом науки и технологий, № 075-10-2022-090 (075-10-2019-083)).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.