Доклады Российской академии наук. Химия, науки о материалах , 2020, T. 495, № 1, стр. 42-45

Бактериальная наноцеллюлоза (БНЦ) является химически чистой целлюлозой с уникальной наноархитектурой фибрилл, благодаря чему приобретает ряд специфических свойств, не характерных для целлюлозы растительного происхождения (высокая влагоудерживающая способность, прозрачность, проницаемость для газов и жидкостей, высокая механическая прочность и т.д.). Поэтому БНЦ востребована в различных отраслях, как традиционных для растительной целлюлозы (целлюлозно-бумажная и химическая промышленность), так и новейших (биотехнологическая промышленность, биомедицина, электроника, получение композиционных материалов) [1–4]. Потребность в БНЦ в глобальных масштабах оценивается в 504 т в год [1].

При производстве БНЦ стоимость питательной среды может достигать 65% от общей стоимости процесса [5]. Поэтому замена дорогостоящих синтетических питательных сред на питательные среды из дешевого целлюлозосодержащего сырья (сельскохозяйственных и лесосечных отходов, быстрорастущих растений, отходов целлюлозно-бумажных и текстильных производств) является востребованным мировым технологическим трендом [2, 3].

Потенциальное целлюлозосодержащее сырье для массового биотехнологического производства должно отвечать критериям доступности, низкой стоимости, ежегодной возобновляемости, стабильности химического и микробиологического состава [2]. В этой связи перспективным источником целлюлозосодержащего сырья для производства БНЦ может стать быстрорастущее растение мискантус. Несмотря на востребованность мискантуса в мире в контексте циркулярной экономики (экономики замкнутого цикла) [6, 7], его использование для получения БНЦ впервые было предложено нами [8, 9] и других примеров в мировой литературе нет. Это высокопродуктивное, простое в агротехнике, устойчивое к заболеваниям растение, которое может успешно выращиваться на бедных почвах в условиях рискованного земледелия, включая континентальную Сибирь [10]. При однократной посадке ежегодно дает стабильные урожаи от 10 до 20 т га^–1 в течение 15–20 лет [8, 9].

Обоснование технологической схемы превращений целлюлозосодержащего сырья в БНЦ было нами отработано на шелухе овса [11] и в настоящей работе эта схема использована в экспериментальной части для трансформации мискантуса.

Мискантус подвергали двухстадийной химической обработке 4.0%-ми растворами гидроксида натрия и азотной кислоты с получением технической целлюлозы. Далее проводили ферментативный гидролиз технической целлюлозы при начальной концентрации субстрата 30.0 г л^–1. Ферментативный гидролизат отфильтровывали, стандартизировали по концентрации редуцирующих веществ (РВ) – 20.0 г л^–1, так как именно при данной концентрации достигается наибольший выход БНЦ [12], и использовали в качестве питательной среды.

В качестве продуцента БНЦ использовали симбиотическую культуру Мedusomyces gisevii Sa-12, концентрация инокулята составила 10.0 об. %. Биосинтез БНЦ проводили стационарным способом в суховоздушном термостате. После завершения культивирования гель-пленки БНЦ отделяли от культуральной среды и промывали разбавленным раствором гидроксида натрия до жемчужно-белого окрашивания, затем проводили декатионирование соляной кислотой [12].

Определение химического состава мискантуса и технической целлюлозы, полученной из него, а также степени полимеризации БНЦ проводили по стандартным методикам [13].

Концентрацию РВ в пересчете на глюкозу определяли с помощью спектрофотометра UNICO UV-2804 (США). Использовали реактив на основе 3,5-динитросалициловой кислоты (Panreac, Испания). Концентрацию пентоз в пересчете на ксилозу определяли с использованием железоорсинового реактива (орсинол моногидрат 99.0%, CAS 6153-39-5; Acros Organics, CША).

Выход БНЦ рассчитывали как отношение массы БНЦ, высушенной на воздухе, (весы лабораторные аналитические Explorer EX-224, CША) к начальной концентрации редуцирующих веществ в среде. Морфология БНЦ исследована методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с помощью микроскопа JSM-840 (Япония). Прочность БНЦ определяли на термомеханическом анализаторе ТМА-60 (Shimadzu, Япония), исследуемый образец растягивался со скоростью 5.0 г мин^–1 от 0.0 г до максимальной нагрузки 400.0 г до разрыва, температура проведения опыта 23.0 ± 2°С.

Рентгеноструктурный анализ (РСА) проводили на дифрактометре ДРОН-6 (Буревестник, Россия). Спектральные характеристики рентгенограмм рассчитывались в программном комплексе PdWin [14]. Подробно методика расчета размеров индекса кристалличности и методика полнопрофильного анализа описаны в [8].

Химический состав мискантуса и технической целлюлозы из него представлены в табл. 1.

По данным табл. 1 предварительная химическая обработка мискантуса приводит к увеличению содержания целлюлозы в 1.8 раза, снижению содержаний кислотонерастворимого лигнина в 35 раз, золы – в 3.9 раза, пентозанов – в 3.5 раза.

После ферментативного гидролиза выход РВ составил 81.0% от массы технической целлюлозы, концентрация РВ составила 27.0 г л^–1. После стандартизации полученная питательная среда содержала 20.6 г л^–1 глюкозы и 0.6 г л^–1 ксилозы.

Через 8 сут выход БНЦ достиг 5.7% и далее не изменялся. Аналогичная зависимость зафиксирована при получении БНЦ из плодовых оболочек овса аналогичным способом [11], при этом выход БНЦ составлял 4.8%. Переход на мискантус позволил немного увеличить выход БНЦ (в 1.2 раза), однако, это ниже, чем при использовании полусинтетической глюкозной среды, когда выход составил 9.0% [12].

На рис. 1 представлены микрофотографии образцов БНЦ, полученные из мискантуса и плодовых оболочек овса, по сравнению с контрольным образцом из глюкозы. Во всех случаях получено характерное именно для БНЦ неупорядоченное трехмерное переплетение микрофибрилл БНЦ [1], значимых отличий между образцами не выявлено.

Рис. 1.

Микрофотографии образцов БНЦ, полученных из мискантуса (а) и плодовых оболочек овса (б) по сравнению с контрольным образцом из глюкозы (в); СЭМ, увеличение ×5000.

При получении БНЦ на гидролизных средах можно отметить снижение степени полимеризации в 2.5 раза по сравнению с глюкозной средой (табл. 2). Тем не менее значения степени полимеризации всех образцов БНЦ соответствуют средним показателям в мировой литературе: 300–10 000 [1]. Также модуль Юнга образца БНЦ из мискантуса ниже, чем модуль Юнга контрольного образца в 1.5 раза, но выше, чем образца БНЦ из плодовых оболочек овса в 1.2 раза. Это вполне закономерно, так как модуль Юнга зависит от толщины образца, т.е. по сути, от выхода БНЦ. В мировой литературе приведены как более высокие (15–138 ГПa [1]), так и более низкие значения данного показателя (10–17 МПа [15]).

Интересно, что структура всех образцов БНЦ, исследованная методом РСА, оказалась идентичной. Концентрация алломорфа Iα составила 98–100%, а индекс кристалличности составил 85–88%, что менее погрешности определения (±5%). Идентичность структурных показателей свидетельствует о том, что, независимо от используемого сырья, культура Мedusomyces gisevii Sa-12 способна синтезировать БНЦ стандартного качества. При этом БНЦ характеризуется экстраординарно высокими содержанием алломорфа Iα и степенью кристалличности. В мировой литературе содержание алломорфа Iα варьирует от 64.0 до 90.0% [1], а степень кристалличности от 46.0 до 95.6% [3].

Таким образом, показана возможность трансформации мискантуса в бактериальную наноцеллюлозу, характеризующуюся 100%-м соответствием структуры алломорфу Iα и высоким индексом кристалличности, равным 85.0%. Полученные данные могут стать основой для разработки технологии биосинтеза БНЦ с последующим созданием крупномасштабного производства.