Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 491, № 1, стр. 168-171

Применение современных технологий для анализа генома и транскриптома показывает, что онкотрансформация клеток связана со структурными нарушениями генов, кодирующих белки и регуляторные РНК, и изменениями их экспрессии. Актуальной задачей является исследование этих генетических и эпигенетических изменений, поскольку они могут выступать в качестве показателей риска развития опухолей.

В настоящее время показано, что появление в организме злокачественных новообразований, включая солидные опухоли, активирует пластичность клеток в опухолевом микроокружении и КМ, направленную как на стимуляцию врожденного иммунитета, так и защиту новообразований [1].

В процессе онкотрансформации иммунокомпетентных клеток могут принимать участие различные факторы: активные формы кислорода (АФК), регуляторные РНК и цитокины. В литературе описано возникновение лимфом в отдаленные сроки после действия сублетальных доз радиации на мышей [2].

Целью нашей работы явилось изучение изменения экспрессии генов и некодирующих РНК в КМ мышей в отдаленные сроки после воздействия низкомощностного пролонгированного облучения.

В работе использовали мышей-гибридов (CBA × C57Bl) F1, самцов массой 20–24 г. Исследования проводили в соответствии с требованиями нормативно-правовых актов. Пролонгированное облучение мышей в дозе 12.6 Гр осуществляли на цезиевой гамма-установке Панорама-3С (10 мГр/мин). После облучения определяли профили экспрессии мРНК генов (p53, PTEN, TNFα, NFκβ(p50), NFκβ(p65), G-SCF, IAP-1, IAP-2, IκBα, iNOS, TAL1, CTCF), днРНК (NEAT1, MALAT1, DINO, lnc p21) и микроРНК (miR-21, miR-125b, miR-145) в КМ, полученном от 89 и 94 мышей на 8 и 10 месяцы после облучения соответственно.

Общую РНК и кДНК получали с использованием наборов фирмы ООО “Лаборатория Изоген” (Россия), ПЦР-РВ осуществляли с применением наборов “Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)” и специфических праймеров. Последовательность праймеров подбирали с помощью базы данных NCBI, а условия проведения ПЦР – экспериментальным путем. Уровень экспрессии исследуемых показателей нормировали относительно мРНК гена GAPDH.

Расчет относительной экспрессии исследуемых показателей проводили по методу ΔΔCt. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы “STATISTICA7.0”. Для оценки достоверности различий применяли непараметрический критерий Манна–Уитни при уровне значимости p < 0.05.

Статистически значимые отличия показателей на 8 и 10 месяцы после облучения от данных необлученного контроля представлены в табл. 1. На 8 месяц наблюдалось увеличение содержания мРНК в КМ у облученных мышей для генов NFkB(р50), NFkB(р65), G-SCF и iNOS.

NF-κB индуцирует экспрессию цитокинов, а также гена MDM2 и miR-21, которые ингибируют активность р53-зависимой системы сохранения стабильности генома и, таким образом, способствуют увеличению жизнеспособности облученных клеток с поврежденным геномом и сохранению их пролиферативной активности [3].

Индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS) генерирует свободные радикалы, оказывающие генотоксическое действие и участвующие в развитии рака [4].

На 8 месяц отмечается увеличение экспрессии NFkB и его генов – мишеней (iNOS, G-SCF), контролирующих пролиферацию и сохранение клеток с поврежденным геномом, что помогает злокачественным клеткам сохранять способность к выживанию. Следует отметить, что активацию NFkB в клетках КМ наблюдали уже на 6 месяц после облучения (1 Гр) мышей [5].

Таким образом, увеличение экспрессии изученных генов в КМ на 8 месяц может способствовать развитию состояния нестабильности генома, и, как следствие, выступать в качестве предикторов онкотрансформации клеток.

У 14 из 94 мышей, проанализированных на 10 месяц, гистологически были выявлены лимфомы в печени, брюшной полости и подкожно. В КМ мышей с опухолями отмечается значительное снижение экспрессии мРНК генов NFkB(р65), iNOS, CTCF, TAL1, днРНК NEAT1 и miR-125b по сравнению с показателями группы контроля и мРНК генов PTEN, iNOS, днРНК lnc p21 и miR-125b по отношению к группе облученных животных без опухолей.

Следует отметить, что к 10 месяцу в КМ мышей с опухолями гены и микроРНК, обладающие свойствами онкогенов (NFkB(р65), TAL1, lnc NEAT1 и miR-125b), либо онкосупрессоров (PTEN, lnc p21) снижают свою активность. У таких животных изменение экспрессии РНК показателей может быть связано не только с облучением, но и проникновением в КМ выделяемых опухолями “онкосом”.

С другой стороны, ниши, с поврежденным геномом возникшие в гемопоэтических стволовых клетках (ГСК) и сохранившиеся на 8 и 10 месяцы после облучения и возникающий из них пул прогениторных клеток в отдаленные сроки после облучения при выходе из КМ, увеличивают риск возникновения периферических новообразований.

Применение регрессионного анализа показало, что уровень экспрессии NFkB, определяемый на 8 месяц в КМ облученных мышей коррелировал с последующим выходом лимфом на 10 месяц после воздействия радиации (R = 0.9; p < 0.05).

Ген PTEN, lnc p21 и NEAT1 являются мишенями ТФ белка Р53. Мутации в гене р53 или его связывание с MDM2 могут ингибировать транскрипционную активность р53 и снижать экспрессию этих его мишеней [6].

PTEN является онкосупрессором и контролирует процессы образования АФК, клеточной пролиферации и стабильность генома, а также влияет на развитие Т- и В-клеток [7].

Уровень экспрессии miR-125b в КМ важен для регуляции ранних этапов дифференцировки кроветворных клеток. Высокая экспрессия miR-125b наблюдается в ГСК и необходима для сохранения их пула. Нарушение процессов самообновления и дифференцировки ГСК могут способствовать онкотрансформации [8].

Lnc p21 подавляет пролиферацию клеток и индуцирует апоптоз. Ее взаимодействие с MDM2 приводит к активации ТФ Р53. Наблюдаемый нами на 10 месяц в КМ пониженный уровень lnc p21 формируется и в лимфомах, и может служить прогностическим маркером.

Таким образом, изменение активности генов, днРНК и микроРНК, участвующих в гемопоэзе, может свидетельствовать о пластичности клеток не только в микроокружении опухоли, но и в КМ. Изучение экспрессии генов и некодирующих РНК и их взаимодействия важно для понимания процессов канцерогенеза, и в перспективе может быть использовано в качестве показателей риска развития лимфом и терапевтических мишеней для лечения новообразований.