Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 329-332

Эндованилоиды – семейство биологически активных липидов – модуляторов нервной и иммунной системы; их типичные представители – N-ацилдофамины (NADA), содержащие остатки длинных насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Основными рецепторами эндованилоидов являются два классических каннабиноидных рецептора CB1 и CB2, ванилоидный рецептор TRPV1 и неклассический каннабиноидный рецептор GPR55. Функционирование большинства этих рецепторов, кроме CB2, зависит от целостности липидных рафтов. CB1 и GPR55 находятся в рафтах, и их активность уменьшается с разрушением последних [1]. Активность TRPV1 также зависит от липидных рафтов, но только для некоторых агонистов [3]. Мы предположили, что активность эндованилоидов должна отрицательно коррелировать с содержанием холестерина в клетках. Цель работы – проверить влияние содержания холестерина на цитотоксичность ацилдофаминов.

Известно, что ацилдофамины индуцируют апоптотическую гибель клеток, активируя рецепторы CB1, GPR55 или TRPV1 на плазматической мембране [5–7]. Поэтому индукция гибели клеток была выбрана в качестве детектируемого параметра. В качестве модели были использованы линии клеток человеческого рака молочной железы: нетуморогенная MCF 10A и высокометастатическая MDA-MB-231 как линии с потенциально разным состоянием системы метаболизма холестерина [8]. В работе были изучены дофаминамиды арахидоновой (AA-DA), олеиновой (Ol-DA) и докозагексаеновой (DHA-DA) кислот.

Исследуемые ацилдофамины синтезировали по ранее разработанным нами методикам [2]. Продукты очищали колоночной хроматографией. Чистоту финального продукта оценивали с помощью микроколоночной обращенно-фазовой ВЭЖХ, структуру подтверждали с помощью ¹H-ЯМР и масс-спектрометрии ESI. Все соединения, использованные в экспериментах, имели чистоту не менее 97%.

Клетки MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) и MCF 10A (ATCC CRL-10317) культивировали в питательной среде DMEM с добавлением 4 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной коровьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2.5 мкг/мл амфотерицина B при 37°С и 5% CO₂. Плотность клеток накануне экспериментов была 60 000 на лунку 96-луночного планшета. Инкубацию с тестируемыми соединениями проводили в течение суток. Вещества растворяли в равном объеме свежей среды и добавляли к клеткам с удалением старой среды из лунок. Стоковые растворы веществ готовили в диметилсульфоксиде, финальная концентрация растворителя не превышала 0.5%. Для оценки жизнеспособности клеток использовали ресазуриновый тест. Каждый эксперимент повторяли три раза.

Содержание холестерина измеряли с помощью набора Sigma-Aldrich Cholesterol Determination Kit.

Экспрессию генов каннабиноидных рецепторов проводили с помощью ОТ-кПЦР, последовательности праймеров: CB1 прямой CAAGCCTCTCTGGCACTTT, обратный CTGGTGGTTGGGCCTATTT; CB2 прямой CTACACCTATGGGCATGTTCTC, обратный CCTCACATCCAGCCTCATTC; TRPV1 прямой CTGGACCAACATGCTCTACTAC, обратный AGGTCTCTCAGGATCATCTTCT; GPR55 прямой ACTGATGTGCTTCCCTTTGAT, обратный CCTGAACACTGGGTGGTATAAG; Alu-SQ [9] прямой CACAGATCAGGTGTTCCCATAC, обратный CATCTCCAGAGCGTCATTCTT, с нормировкой на ген домашнего хозяйства Alu-SQ.

Для статистической оценки различий использовали дисперсионный анализ с пост-тестом Тьюки, различия считали достоверными при p ≤ 0.05.

Для изменения содержания холестерина клетки помещали в следующие условия: а) среда с сывороткой; б) бессывороточная среда (ограничение поступления внешнего холестерина); в) бессывороточная среда с обработкой клеток в течение 30 мин 5 мМ метил-бета-циклодекстрина (MBCD, экстракция холестерина из мембраны); г) бессывороточная среда с добавлением 20 нМ аторвастатина (подавление синтеза холестерина через ингибирование ключевого фермента – 3-гирокси-3-метилглутарил-КОА редуктазы). Инкубация клеток в вышеприведенных условиях не приводила к потере жизнеспособности, что было оценено в отдельном эксперименте (данные не приведены). В культуре клеток MCF 10A удаление сыворотки привело к снижению содержания холестерина, которое еще больше снизилось в присутствии MBCD, а максимальное падение зафиксировано при ингибировании собственного биосинтеза холестерина аторвастатином. Напротив, в культуре MDA-MB-231 удаление сыворотки привело к незначительным изменениям содержания холестерина, а добавление к бессывороточной среде MBCD и аторвастатина понижало содержание холестерина практически в равной степени (рис. 1).

Рис. 1.

Содержание холестерина в клетках MCF 10A (а) и MDA-MB-231 (б) в разных условиях. M ± SD, n = 3 эксперимента. * – статистически достоверное отличие от среды с сывороткой, ** – статистически достоверное отличие от среды без сыворотки.

Использованные линии клеток таким образом представляют собой два разных варианта поддержания уровня холестерина: MCF 10A обладает одновременно активными системами и биосинтеза, и захвата холестерина из среды, а в MDA-MB-231 захват холестерина практически не задействован, а собственный его биосинтез, по видимому, протекает с низкой скоростью, и внутриклеточный пул холестерина в меньшей степени подвержен влиянию ингибитора.

Экспрессия рецепторов каннабиноидной системы, количественно оцененная по уровню их мРНК, в рассматриваемых линиях клеток весьма близка (рис. 2), и потому можно было ожидать, что цитотоксичность ацилдофаминов будет прогрессивно снижаться в MCF 10A по мере разрушения рафтов, и ступенчато изменяться в MDA-MB-231.

Рис. 2.

Экспрессия рецепторов каннабиноидной системы в клетках MCF 10A и MDA-MB-231. Уровень мРНК, данные ОТ-кПЦР. Здесь и на рис. 3 M ± SEM, n = 3 эксперимента.

Вопреки ожиданиям, снижение содержания холестерина без воздействия на ферментативную систему приводило к усилению цитотоксичности ацилдофаминов (рис. 3). При этом ингибирование биосинтеза холестерина практически не влияло на токсичность ацилдофаминов, а максимальный эффект был вызван экстракцией холестерина с помощью MBCD.

Рис. 3.

Цитотоксичность (EC₅₀) NADA на фоне разного уровня холестерина, (а) MCF 10A, (б) MDA-MB-231. Инкубация 24 ч, ресазуриновый тест, * – статистически достоверное отличие от среды с сывороткой, ** – статистически достоверное отличие от среды без сыворотки.

С одной стороны, обнаруженное усиление цитотоксичности противоречит литературным данным о потребности в холестерине для функции каннабиноидных и ванилоидных рецепторов. Однако, липидные рафты могут также действовать как негативные регуляторы GPCR за счет либо физической секвестрации сигнальных компонентов, либо интернализации рецепторных молекул посредством эндоцитоза, связанного с кавеолами [4]. Таким образом, частичного разрушения рафтов может быть достаточно, чтобы убрать это действие.

Участие эндоцитоза в рассматриваемом явлении представляется менее вероятным, поскольку одновременно с его прекращением будет нарушаться и система передачи внутриклеточного сигнала от ацилдофаминов, компоненты которой также локализуются в рафтах. С другой стороны, рафты могут ограничивать доступность ацилдофаминов для рецепторов. В пользу этой гипотезы говорит и существенно более выраженное усиление цитотоксичности Ol-DA – вещества с наиболее насыщенным остатком жирной кислоты – на фоне действия MВCD.

Парадоксальное на первый взгляд отсутствие влияния аторвастатина по сравнению с MBCD можно объяснить тем, что в условиях снижения синтеза холестерина клетка будет стараться поддерживать его содержание в жизненно важных частях, то есть в рафтах, жертвуя внутриклеточными ресурсами. MBCD, с другой стороны, в первую очередь экстрагирует холестерин именно из мембраны с сопутствующим разрушением рафтов.

Обнаруженное усиление действия ацилдофаминов согласуется с данными в работе Wojtalla с соавт., где на культуре клеток печени добавление MBCD снижало токсичность анандамида, но не AA-DA [10].

Таким образом, уровень холестерина в клетках является важным параметром, определяющим их чувствительность к цитотоксическому действию эндованилоидов ацилдофаминов. Снижение содержания холестерина в клетках и, прежде всего в цитоплазматической мембране, приводит к повышению цитотоксичности ацилдофаминов, предположительно в результате разрушения рафтов. Данный результат важен для разработки новых терапевтических стратегий борьбы с онкологическими заболеваниями, основанных на использовании эндогенных противораковых соединений и малых молекул, синтезированных на шаблоне их структур.