Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 353-358

Малые некодирующие РНК бактерий модулируют широкий спектр физиологических ответов и регулируют ключевые этапы жизнедеятельности у целого ряда возбудителей заболеваний [1, 2]. В последнее время обсуждается идея о том, что малые РНК внутриклеточных патогенных бактерий могут не только адаптировать собственный транскриптом под меняющиеся условия, но также взаимодействовать с транскриптомом инфицированного организма, вмешиваясь тем самым в процессы антибактериальной защиты. Выявление и исследование молекулярных цепей адаптации патогенных бактерий к иммунной защите хозяина при персистировании в макрофагах представляет собой важную научную проблему.

В данной работе исследуется малая некодирующая РНК Mycobacterium tuberculosis MTS1338, которая специфична только для микобактерий туберкулезного комплекса, и уровень ее экспрессии in vivo чрезвычайно высок и составляет приблизительно 10^–1 относительно уровня экспрессии 16S rRNA [3]. Ранее было показано, что MTS1338 вносит существенный вклад во взаимодействие M. tuberculosis с макрофагами, адаптируя бактериальный транскриптом к агрессивной внутримакрофагальной среде. Изменения в метаболизме бактерий, вызываемые гиперэкспрессией этой малой РНК, приводят к модуляции иммунного ответа [4].

Существуют примеры того, как некодирующие бактериальные РНК внутриклеточных патогенов могут секретироваться в цитоплазму инфицированных клеток и модулировать иммунный ответ во время инфекции [5, 6]. Предполагается, что малая РНК M. tuberculosis MTS1338 также может секретироваться и влиять на защитные клетки иммунной системы. Для изучения этого процесса востребована система визуализации малых РНК бактерий с помощью флуоресцентной микроскопии.

Общий подход для визуализации исследуемой РНК в клетке – экспрессия этой РНК совместно с РНК-аптамером, способным связывать небольшую молекулу-флуорофор и активировать ее флуоресценцию (так называемая модульная РНК) [7]. Добавляя флуорофор в среду инкубирования клеток, экспрессирующих модульную РНК, мы имеем возможность определить клеточную локализацию малой РНК. Изначально методика была основана на использовании в качестве аптамера РНК, связывающую из раствора зеленый флуоресцентный белок (GFP) [8], однако для этой и других подобных методик требуется ко-экспрессия флуоресцентных белков в клетке, что может привести к неспецифической флуоресценции белков, не связавшихся с РНК [7]. В альтернативной стратегии используются последовательности РНК, которые благодаря своей особой третичной структуре способны связывать из раствора непосредственно саму молекулу-флуорофор и активировать ее флуоресценцию [9]. Как было показано Paige с соавторами [10], структурный аналог GFP, флуорофор DFHBI, (Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene)-1,2-dimethyl-1H-imidazol-5(4H)-one), не вызывал неспецифическую флуоресценцию при его активации различными компонентами клеток, такими как клеточная РНК или ДНК. Среди последовательностей РНК-аптамеров хорошо зарекомендовала себя т.н. Broccoli, а также ее производные. Broccoli достаточно короткая (49 п.н.), обладает стабильной вторичной структурой, формирование которой мало зависит от биохимического состава среды, а также имеет яркую зеленую флуоресценцию при взаимодействии с модифицированным аналогом DFHBI, DFHBI-1T [11]. Была продемонстрирована возможность применения производных Broccoli для детекции некодирующих РНК в различных организмах [12, 13].

В серии ранее опубликованных работ было выяснено, что использование различных вариантов аптамера Broccoli может приводить к разной интенсивности флуоресценции и изменять правильный фолдинг исследуемой РНК [11–13]. С целью подбора оптимальных по размеру и яркости конструкций в данной работе использовались различные по длине аптамеры. Были сконструированы модульные РНК MTS1338 с Broccoli, 2xdBroccoli, F30-Broccoli, F30-2xdBroccoli, обладающие разными размерами и яркостью флуоресценции. C помощью сервера RNAfold (http://rna.-tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi) для всех сконструированных РНК была показана высокая вероятность образования правильной вторичной структуры, содержащей два функциональных домена – MTS1338 и аптамер (рис. 1А). Структура модульных РНК и используемые для их получения олигонуклеотидные праймеры приведены в табл. 1.

Рис. 1.

(а) Вторичная структура РНК модулей MTS1338_Broccoli, MTS1338_2xdBroccoli, MTS1338_F30-Broccoli, MTS1338_F30-2xdBroccoli согласно серверу RNAfold. Часть модуля, соответствующая MTS1338, выделена прямоугольником. (б) Флуоресценция модульных РНК in vitro. Модульные РНК (100 нг) фракционировали в 6% полиакриламидном геле, инкубировали гель в растворе флуорофора (10 мкМ DFHBI-1Т, 40 мМ HEPES pH 7.4, 100 мМ KCl, 1 мМ MgCl₂) и анализировали с помощью флуоресцентного визуализатора ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad) с использованием зеленого канала прибора.

Для того, чтобы убедиться в возможности укладки модульной РНК в правильную вторичную структуру, при которой РНК может флуоресцировать при взаимодействии с DFHBI-1T, сконструированные модульные РНК синтезировали in vitro с использованием набора T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System (Promega), разделяли в полиакриламидном геле, инкубировали в растворе флуорофора DFHBI-1Т и анализировали с помощью флуоресцентного визуализатора ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad) с использованием зеленого канала прибора (рис. 1б). Максимальная флуоресценция наблюдалась для РНК MTS1338-F30-2xdBroccoli, поэтому дальнейшие эксперименты проводили с этим аптамером.

В составе шаттл-вектора pMV261, способного реплицироваться как в E. coli, так и в микобактериях [14], генетическая конструкция MTS1338-F30-2xdBroccoli была трансформирована в Myco-licibacterium smegmatis MC² 155. Эти непатогенные бактерии используются в качестве суррогатного организма при изучении M. tuberculosis, поскольку их геномы, а также метаболизм очень сходны, при этом M. smegmatis обладает значительно большей скоростью роста и гораздо легче подвергается генетической модификации [15]. M. smegmatis не содержит гена исследуемой малой РНК.

Для визуализации модульных РНК в бактериях внутри макрофагов проводили инфицирование клеточной культуры макрофагов мыши RAW 264.7 (ATCC® TIB-71™) штаммом M. smegmatis MTS1338-F30-2xdBroccoli. Макрофаги, выращенные на покровных стеклах в среде RPMI-1640, 10% FCS при 5% CO₂, 37°C до конфлуэнтности 70%, инфицировали с MOI 10:1 (множественность инфекции – количество бактерий на один макрофаг). Инфицирование проводили в течение 1 ч. После инфекции среду удаляли, промывали макрофаги PBS и анализировали препараты на конфокальном микроскопе Eclipse TE2000 (Nikon, Япония) (рис. 2). На полученных изображениях наблюдалась колокализация зеленых (флуоресцирующие модульные РНК) и красных (бактерии) сигналов, что свидетельствует о том, что модульная РНК, содержащая MTS1338, синтезируется, складывается в корректную вторичную структуру и взаимодействует с флуорофором в микобактериях, поглощенных макрофагами. Также были отмечены зеленые сигналы в цитоплазме макрофагов, окружающие бактерии. Возможно, эти сигналы указывают на секрецию в цитоплазму макрофагов MTS1338 в составе модульной РНК, что будет проверено нами в дальнейшем.

Рис. 2.

Визуализация генетически кодируемой модульной РНК MTS1338-F30-2xdBroccoli внутри макрофагов RAW 264.7, инфицированных M. smegmatis. Схема эксперимента приведена слева; prom, term – промотор и терминатор соответственно. Конфокальная микроскопия (справа). Клеточные ядра окрашивали Hoechst 33258 (9 мкM) в течение 15 мин во время инфекции. Детекцию бактерий (красный) и бактериальных модульных РНК (зеленый) осуществляли путем добавления красного красителя мембран FM4-64 (8 мкM) в инкубационную среду бактерий за 30 мин до инфицирования макрофагов и флуорофора DFHBI-1T (40 мкM, согласно [12]) при визуализации.

Таким образом, мы впервые продемонстрировали возможность детекции методом флуоресцентной микроскопии малых бактериальных РНК при персистировании бактерий внутри макрофагов. Данная система в дальнейшем будет использована в исследованиях по выявлению роли малых РНК M. tuberculosis в патогенезе туберкулеза, процессов секреции этих РНК в инфицированных макрофагах, поиска их эукариотических мишеней, а также молекулярных путей, на которые могут оказывать воздействие эти малые РНК.