Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 367-372

Поддержание стабильности генома имеет важное значение для клеточного гомеостаза и сильно зависит от точности процесса репликации ДНК, сегрегации хромосом, а также репарации ДНК. Повреждения ДНК могут возникать под воздействием различных факторов: химических канцерогенов в окружающей среде; метаболитов, вырабатываемых кишечной микробиотой; свободных радикалов, продуцируемых активированными иммунными клетками – моноцитами и макрофагами; ультрафиолетового и ионизирующего излучения, а также некоторых фармацевтических препаратов, например, генотоксических противоопухолевых лекарств [1]. Эти и другие факторы приводят к мутациям генов и повреждениям хромосом. В зависимости от типа повреждения ДНК и стадии клеточного цикла для репарации задействуются различные ответные клеточные реакции [2]. Они имеют общий принцип действия: повреждение ДНК вызывает изменения в ее структуре или остановку репликации, что распознается сенсорными белками. Данные белки рекрутируют сигнальные и нижестоящие эффекторные белки, которые в свою очередь инициируют каскады, запускающие клеточные процессы для репарации повреждений ДНК или устранения клеток с непоправимыми изменениями. Репарация повреждений ДНК, в особенности двухцепочечных разрывов, которые считаются наиболее опасными, имеет решающее значение для поддержания целостности генома и клеточного гомеостаза [3]. Клеточный ответ на двухцепочечные разрывы ДНК требует сложного и многоступенчатого взаимодействия различных факторов, в числе которых посттрансляционные модификации хроматина и хроматин-ассоциированных белков.

Хроматин представляет из себя высококомпактизованную и динамическую структуру, которая регулирует доступность ДНК во время различных клеточных событий. Хроматин обычно существует в двух формах: плотно упакованного гетерохроматина и имеющего деспирализованные участки эухроматина. В состав хроматина входят ДНК, гистоны, негистоновые белки и РНК. Структура хроматина может регулироваться различными процессами, одним из которых является посттрансляционные модификации (ПТМ) гистонов [4].

Одним из важнейших видов ПТМ гистоновых белков является убиквитинирование, которое, помимо репарации, участвует в большом количестве клеточных процессов, таких как деградация, сортировка, локализация, активация и репрессия синтеза белков. Известно до 14 различных семейств убиквитина и убиквитин-подобных белков, различающихся по аминокислотной последовательности, но имеющих характерную пространственную структуру. Ковалентное присоединение убиквитина к субстратам осуществляется при помощи системы, состоящей из трех ферментов – E1 (activating enzyme), E2 (conjugating enzyme) и убиквитин-лигазы E3. Специфичность модификации субстратов достигается за счет иерархичности системы убиквитинирования. Так, в клетках млекопитающих существует всего два типа убиквитин-активирующих ферментов E1 – Uba1 и Uba6, около 55 конъюгирующих ферментов Е2 и около 600 убиквитин-лигаз Е3 [5].

Существует множество способов модификации белков убиквитином, из которых выделяют моноубиквитинирование (одного или нескольких сайтов), а также полиубиквитинирование с разными параметрами связи и длинами убиквитиновых цепей [6]. Семь ε-аминогрупп аминокислотных остатков лизина (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63), входящих в состав убиквитина, позволяют ему образовывать изопептидные связи. Как правило, первый убиквитин присоединяется своей С-концевой карбоксильной группой к аминогруппе остатка лизина, входящего в полипептидную цепь субстрата. Дальнейший рост цепи обусловлен образованием изопептидных связей между внутренними аминокислотными остатками лизинов уже встроенного убиквитина и С-концевым остатком глицина нового убиквитина. Параметры цепей крайне разнообразны: они могут быть как гомогенными (то есть образовывать связи через аминокислотные остатки лизинов в строго определенном положении), так и гетерогенными (комбинировать разные типы связей), последние в свою очередь могут разветвляться посредством убиквитинирования сразу по нескольким сайтам. Считается, что значение сигнала убиквитинирования зависит от типа связи и длины убиквитиновой цепи. Удаление этих сигналов осуществляется с помощью деубиквитинирующих ферментов (DUB). Функциональные роли убиквитиновых цепей, образованных через аминокислотные остатки лизина K48 и K63 в составе убиквитина, достаточно хорошо изучены. K48-полиубиквитинирование считается сигналом протеасомной деградации, тогда как K63-убиквитинирование обеспечивает белок-белковые взаимодействия в различных процессах, в том числе при репарации ДНК [7]. Помимо важности K11 и M1 (линейные цепи, образованные через N-концевой метионин) убиквитиновых связей в регуляции клеточного цикла и активации NF-κB [8, 9], мало что известно о функциях других неканонических цепей убиквитина (K6, K27, K29, K33).

Сравнительно недавно стало известно о существенной роли убиквитинирования в некоторых механизмах репарации ДНК [10]. Так, активация серин/треониновой протеинкиназы, индуцированная двухцепочечными разрывами ДНК, вызывает каскад фосфорилирования и убиквитинирования белков, благодаря чему образовываются супрамолекулярные комплексы, координирующие клеточный ответ на повреждения ДНК. При таком типе повреждения ДНК благодаря деятельности двух убиквитин-лигаз, RNF8 и RNF168, которые модифицируют гистоны хроматина H2A и H2A.X, а также гистон H1, в непосредственной близости от повреждения, к месту разрыва привлекаются различные факторы репарации. Модифицированные убиквитином белки в местах повреждения могут быть подвергнуты деубиквитинированию соответствующими ферментами [11]. Известно, что сайт моноубиквитинирования гистона  Н2А E3 лигазой RNF168 расположен в N-концевой части белка на аминокислотных остатках K13/K15 [12, 13], однако, убиквитинирование данного гистона может осуществлять и по остаткам K118/K119 [14]. Ранее было показано, что убиквитинирование по остаткам K13/K15 RNF168 осуществляет зависимо от аминокислотного остатка К27 в составе убиквитина [15]. До сих пор неочевидно, почему для данной модификации столь существенен именно этот аминокислотный остаток в составе убиквитина.

На сегодняшний день существует широкий набор методов визуализации белков в живой клетке, но, несмотря на это, поиски альтернативных способов не прекращаются. Относительно недавно был предложен метод сайт-специфического внутриклеточного мечения белков PRIME (PRobe Incorporation Mediated by Enzymes), основой которого является модифицированная липоат-лигаза типа A (LplA), содержащая три мутации в активном центре E20A/F147A/H149G [далее LplA(AAG)], способная ковалентно присоединять молекулу низкомолекулярного флуорофора резоруфина (ex/em 560/585 нм) к аминогруппе лизина в составе специфической 13-членной аминокислотной последовательности (ligase acceptor peptide, LAP), слитной с белком-мишенью [16]. Следуя вышеописанной методологии, последовательности ДНК, кодирующие убиквитин в единой рамке считывания с пептидом LAP (LAP-Ub), были интегрированы в лентивирусный вектор, кодирующий слитный белок BFP-LplA(AAG), где BFP – мономерный вариант синего флуоресцентного белка. Последовательности LAP-Ub и BFP-LplA(AAG) перемежались сайтом внутренней посадки рибосомы (IRES, Internal Ribosome Entry Site), и находились под контролем CMV промотора. При этом пептид LAP был сопряжен с N-концом убиквитина, что, согласно имеющимся литературным данным, не должно драматически повлиять на физиологические свойства последнего [17]. С-конец белка был сохранен в нативной форме, чтобы обеспечить рекомбинантному LAP-Ub все функции Ub дикого типа.

Клетки HEK293, стабильно экспрессирующие LAP-Ub (все дальнейшие варианты Ub содержали LAP и далее обозначаются как Ub) и ZsGreen-LplA(AAG), инкубировали с 5 мкМ резоруфина в течение 20 мин. Затем клетки многократно промывали средой DMEM для удаления непрореагировавшего субстрата. Увеличение концентрации флуорофора и времени инкубации затрудняет процесс вымывания несвязавшегося резоруфина из клеток, что, в свою очередь, осложняет интерпретацию результатов. Отмытые клетки лизировали, далее лизаты анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с последующей визуализацией флуоресценции в геле, а также иммуноблоттинга (рис. 1а). При анализе массового распределения полиубиквитиновых конъюгатов, была зафиксирована интенсивная полоса с массой около 25 кДа, которая была идентифицирована как моноубиквитинированный гистон H2A/H2A.X [15] (рис. 1а). Распределение интенсивности флуоресценции свидетельствует, что гистон Н2А акцептирует на себя до 10% меченного резоруфином убиквитина.

Рис. 1.

(а) Клетки HEK293, экспрессирующие Ub и BFP-LplA(AAG) с NLS (nuclear localization signal) или без него, инкубировали с ДМСО (–), ингибитором протеасомы PS-341 (PS) или ингибиторами DUB PR-619 (PR) и WP1130 (WP), а затем обрабатывали резоруфином. Лизаты клеток разделяли в ПААГ, далее детектировали флуоресценцию или проводили иммуноблоттинг с использованием антител против гистона H2A. Нижняя панель демонстрирует совмещение данных флуоресцентного анализа и иммуноблоттинга. Моноубиквитинированный гистон обозначен как Ub-H2A. (б) Флуоресцентная микроскопия клеток, коэкспрессирующих Ub и BFP-LplA(AAG) или BFP-LplA(AAG)-NLS, в синей области видимого спектра. (в) Клетки HEK293, коэкспрессирующие различные варианты Ub совместно с BFP-LplA(AAG), обрабатывали резоруфином. Лизаты клеток разделяли в ПААГ, далее анализировали интенсивность флуоресценции в геле.

Использование лигазы LplA(AAG) с сигналом ядерной локализации (рис. 1б, BFP-LpIA(AAG)-NLS, NLS – nuclear localization signal) показало, что BFP-LpIA(AAG)-NLS была практически не способна модифицировать рекомбинантный Ub (рис. 1а). Данное наблюдение свидетельствует, что H2A подвергается модификации Ub, меченым резоруфином, который диффундирует из цитоплазмы. При дополнительной обработке клеток ингибитором протеасомы PS-341, аналогично работе [18], нами было обнаружено усиление активности деубиквитинирующих ферментов в отношении убиквитинированного гистона (рис. 1а). В то время как обработка ингибиторами DUB PR-619 и WP1130 скорее всего приводит к перераспределению убиквитина на альтернативные мишени и, как следствие, к уменьшению интенсивности полосы, соответствующей убиквитинированному гистону Н2А.

Для изучения особенностей внутриклеточного убиквитинирования гистона H2A были созданы варианты убиквитина, содержащие только по одному функциональному аминокислотному остатку лизина из семи, остальные аминокислотные остатки лизина были заменены на аргинин. Таким образом, в нашем распоряжении было 10 различных вариантов убиквитина: дикий тип убиквитина Ub WT, UbK0 (все семь функциональных аминокислотных остатков лизина заменены на аргинины) и варианты К0 с возвратными заменами UbK0 R6K, UbK0 R11K, UbK0 R27K, UbK0 R29K, UbK0 R33K, UbK0 R48K, UbK0 R63K. Обработка клеток линии НЕК293 резоруфином, коэкспрессирующих данные варианты убиквитина с BFP-LpIA(AAG), и последующий анализ флуоресценции в ПААГ выявил, что полоса, соответствующая гистону H2A, была обнаружена только в случае варианта UbК0 R27К (рис. 1в), что соотносится с ранее опубликованными данными [15]. Для дополнительного подтверждения функциональной значимости аминокислотного остатка лизина К27 в составе убиквитина в процессе модификации гистона Н2А, нами был создан вариант убиквитина дикого типа, в котором на аргинин был заменен исключительно остаток K27 – UbWT K27R. Анализ интенсивности полосы, соответствующей конъюгату Ub-Н2А, подтвердил исключительно важное значение лизина К27 в процессе моноубиквитинирования гистона Н2А (рис. 1в).

Обработка резоруфином клеток линии НЕК293, коэкспрессирующих варианты Ub дикого типа, Ub R48K и UbK0 R27K вместе с BFP-LplA(AAG)-NLS, подтвердили ранее обнаруженный феномен отсутствия мечения всех вариантов Ub, включая вариант К27, в ядре (рис. 2а). Наиболее разумным объяснением данного факта является стерическая недоступность Ub в составе конъюгата Ub-H2A для его модификации флу-орофором. Проведенное сравнение скорости накопления и последующего высвобождения убиквитина дикого типа и варианта UbК0 R27К (рис. 2б) из ковалентного конъюгата с гистоном Н2А выявило факт усиленного депонирования убиквитина в виде ковалентного конъюгата с Н2А в случае UbК0 R27К. При этом динамическое равновесие между цитоплазматическим и ядерным пулом убиквитина достигалось за времена менее 10 мин.

Рис. 2.

(а) Клетки HEK293, коэкспрессирующие Ub, UbK0 K27, UbK0 K48 совместно с BFP-LplA(AAG) с NLS (nuclear localization signal) или без него, обрабатывали резоруфином. Лизаты клеток разделяли в ПААГ, далее анализировали интенсивность флуоресценции в геле. (б) Клетки, стабильно экспрессирующие Ub WT и UbK0 R27K, обрабатывали резоруфином, лизировали в указанные временные промежутки, лизаты разделяли в ПААГ, далее анализировали интенсивность флуоресценции в геле. График демонстрирует интенсивность флуоресценции полосы, соответствующей конъюгатам UbK0 R27К-H2A и UbWT-H2A, в зависимости от времени.

Таким образом, в настоящей работе была продемонстрирована структурная значимость аминокислотного остатка K27 в составе убиквитина в процессе убиквитинирования гистона H2A. Полученные данные вместе с опубликованными ранее [18] позволяют предположить, что убиквитин-лигазы цитоплазматической и ядерной локализации конкурируют между собой за пул убиквитина, постоянно обменивающийся между ядром и цитоплазмой (рис. 3). Наличие только одного функционального аминокислотного остатка лизина К27 в составе убиквитина в значительной степени смещает данное равновесие в сторону образования ковалентного конъюгата с гистоном Н2А.

Рис. 3.

Убиквитин-лигазы цитоплазматической и ядерной локализации конкурируют между собой за пул убиквитина, интенсивно обменивающийся между ядром и цитоплазмой, при этом аминокислотный остаток K27 в составе убиквитина вероятно структурно необходим в процессе моноубиквитинирования гистона H2A E3 лигазой RNF168.

Изученные фундаментальные аспекты моноубиквитинирования гистона Н2А в значительной степени детализируют сигнальную роль данной модификации в процессе репарации ДНК.