Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 373-375

Особенность рибосом-инактивирующих белков второго типа (РИБ-II) – наличие А- и В-субъединиц, соединенных дисульфидной связью [1].

Список сокращений: ERAD – системы контроля качества белков, ассоциированная с ЭПР, RTA – А-субъединица рицина, VTA – А-субъединица вискумина, ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция с детекцией продукта в режиме реального времени, РИБ – рибосом-инактивирующий белок второго типа, ЭПР – эндоплазматический ретикулум

В-субъединица, обеспечивает связывание РИБ-II с мембраной клетки и проникновение путем ретроградного транспорта в эндоплазматических ретикулум (ЭПР). А-субъединица обеспечивает токсическое действие РИБ-II, обладает каталитической N-гликозидазной активностью и необратимо модифицирует рибосомы. Для осуществления токсического действия, в ЭПР должно произойти восстановление дисульфидной связи, соединяющей субъединицы. При этом, происходит частичное разворачивание А-субъединицы и увеличение гиброфобности белковой глобулы, что служит сигналом для ее транслокации через мембрану ЭПР с помощью системы ERAD – системы контроля качества белков, ассоциированной с ЭПР [1–3]. Деградация системой ERAD частично несвернутых белков, эндогенных для ЭПР, включает следующие основные этапы: 1) обнаружение и сортировка, 2) транслокация через мембрану ЭПР и перенос белка в цитоплазму, 3) деградация с помощью протеасомы. А-субъединицы РИБ-II, в отличие от эндогенных белков, после транслокации в цитоплазму способны обратно сворачиваться и, таким образом, избегать деградации в протеасоме [1]. Цитотоксическое действие РИБ-II во многом определяется эффективностью этого процесса, а также временем жизни каталитически активной вновь свернутой А-субъединицы в цитоплазме [4].

В настоящей работе исследовалось влияние изменения экспрессии белков, вовлеченных в процесс деградации белков системой ERAD, на цитотоксичность рицина и вискумина. Данные РИБ-II являются структурными гомологами и обладают одинаковым механизмом действия [5, 6]. Несмотря на то, что А-субъединицы рицина (RTA) и вискумина (VTA) характеризуются близкой каталитической активность [7], эффективность токсического действия рицина и вискумина значительно различается [8–10]. По-видимому, это обусловлено различием стабильности белковых глобул RTA и VTA и способностью их развернутых полипептидных цепей обратно сворачиваться в каталитически активную форму после транслокации в цитоплазму [3]. Нами была получена модификация линии колоректальной аденокарциномы НТ29 (HT29-sh002) [11]. Анализ протеома, проведенный в соответствии с методикой описанной в [11], выявил в клетках данной линии изменение экспрессии ряда белков, вовлеченных в ERAD-ассоциированную деградацию, включая белки протеасомы (табл. 1). Из них наибольшее увеличение экспрессии детектировалось для регуляторной субъединицы протеасомы PSMD11. Ранее было показано, PSMD11 играет ключевую роль в сборке 26S протеасомы, а нокдаун гена этого белка повышает чувствительность клеток к рицину [12]. Таким образом, увеличение экспрессии PSMD11, а также других компонент протеасомы, должно приводить к снижению чувствительности клеток к рицину.

Преимуществом работы с РИБ-II является возможность количественной оценки доли специфически инактивированных ими рибосом с помощью ПЦР-РВ, по методу, разработанному нами ранее [9]. Появление инактивированных рибосом является прямым свидетельством попадания каталитически активных А-субъединиц РИБ-II в цитоплазму. Клетки исследуемых линий обрабатывались рицином или вискумином в течение 1 ч. После этого среду отбирали, клетки промывали и дополнительно инкубировали в среде без РИБ-II в течение 1 ч. Затем клетки лизировали, выделяли РНК, оценивали качество и количество образцов РНК, и проводили детекцию доли инактивированных рибосом в соответствии с работами [9, 13]. Действительно, как предполагалось, в клетках линии HT29-sh002 для всех используемых концентраций рицина доля инактивированных рибосом была ниже по сравнению с исходной линией НТ29 (табл. 2).

Однако, при обработке вискумином, доля инактивированных рибосом в клетках НТ29-sh002 оказалась, наоборот, выше, чем в клетках НТ29 (табл. 2). В отличие от рицина, для которого была показана 26S протеасом-зависимая деградация RTA [1], про деградацию VTA в настоящий момент известно мало. Полученные результаты указывают на то, что в деградации VTA 26S протеасома играет менее важную роль по сравнению с RTA. Это согласуется с отсутствием в аминокислотной последовательности VTA лизинов [3].

Увеличение доли инактивированных VTA рибосом в клетках НТ29-sh002, может быть связано с увеличение экспрессии ко-шаперона Cdc37 (табл. 1). Последний принимает участие в сворачивании белков шапероном Hsp90 и поддержании их стабильности в цитоплазме [14, 15]. Cdc37 может способствовать более эффективному рефолдингу VTA после транслокации в цитоплазму, а также поддерживать ее стабильность между каталитическими актами при взаимодействии с рибосомами.

Таким образом, результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствую о том, что, для VTA деградация 26S протеасомой, по-видимому, менее характерна, по сравнению с RTA. В случае RTA уровень экспрессии регуляторной субъединицы протеасомы PSMD11, по-видимому, имеет в этом процессе важное значение. Роль убиквитин-независимой деградации А-субъединиц рицина и вискумина 20S протеасомой требует дополнительных исследований.