Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 400-403

Клеточные модели кишечного барьера in vitro позволяют изучать различные биологические аспекты, включая барьерную, транспортную, секреторную функции эпителия кишечника, взаимодействие с микробиомом и особенности биологии клеток в нормальных и патологических условиях. Использование в качестве моделей человеческих органов иммортализованных опухолевых клеточных линий, например, клеток колоректальной аденокарциномы человека Caco-2 как модели кишечного барьера [1], позволяет получать хорошо воспроизводимые стандартизованные результаты, исключая вклад множества трудно учитываемых факторов, которые имеются в полноценном живом организме, и снижая вариабельность, присущую первичным культурам клеток [2]. Добавление внеклеточного матрикса и циркуляции питательной среды в микрофлюидных устройствах дополнительно приближает микроокружение моделей барьера к реальным условиям [3]. Однако при изучении биологических процессов на подобных моделях всегда следует помнить о возможных отличиях опухолевых клеток от нормальных.

В настоящее время активно изучается роль микроРНК в регулировании кишечного барьера. МикроРНК – это короткие молекулы РНК длиною порядка 22 нуклеотидов, играющие ключевую роль в процессе РНК-интерференции [4]. Их важнейшая функция заключается в посттранскрипционном подавлении экспрессии генов-мишеней, происходящем за счет комплементарного связывания микроРНК с 3'-нетранслируемой областью целевой мРНК, приводящего к блокированию дальнейшей трансляции и/или деградации мРНК [5].

Процесс образования микроРНК состоит из нескольких этапов. На первом этапе в результате транскрипции образуется молекула при-микроРНК, имеющая структуру шпильки. На следующем этапе созревания внутриядерный фермент Drosha связывается с при-микроРНК и производит разрезание неспаренных концов молекулы с образованием пре-микроРНК [6]. Наконец, после транспортировки пре-микроРНК в цитоплазму фермент Dicer производит разрезание петли шпильки пре-микроРНК, в результате чего образуется две молекулы микроРНК [7], см. рис. 1. Неточность работы двух указанных ферментов приводит к образованию так называемых изоформ микроРНК (isomiRs) – молекул, отличающихся от канонической микроРНК на 1–3 нуклеотидных основания с концов последовательности [8]. Важность учета этих молекул заключается в том, что зачастую неканоническая изоформа микроРНК может преобладать в клетке [9] и приводить к существенному изменению списка генов-мишеней микроРНК [10, 11].

Рис. 1.

Этапы созревания микроРНК.

В настоящем исследовании описанные эффекты были изучены с помощью анализа данных профиля изоформ микроРНК здоровых и опухолевых тканей толстой кишки. Для этого были использованы результаты анализа микроРНК с помощью секвенирования нового поколения в 16 биологических образцах из проекта The Cancer Genome Atlas Colon Adenocarcinoma (TCGA-COAD) [12]. Образцы были получены из здоровых тканей и злокачественных опухолей толстой кишки, по два образца у каждого из восьми пациентов. Результаты секвенирования микроРНК были получены в виде таблицы экспрессий изоформ микроРНК, содержащей информацию о количестве ридов, соответствующих каждой изоформе (количества были нормированы на миллион выровненных ридов).

Из анализа были исключены слабо экспрессированные изоформы микроРНК, а именно изоформы, средняя экспрессия которых была меньше 100 ридов на миллион выровненных. Для сравнения профилей экспрессии изоформ микроРНК между здоровыми и патологическими тканями, была проведена агломеративная иерархическая кластеризация образцов методом Варда [13] на основе данных наиболее ярко экспрессированных изоформ (средняя экспрессия больше 1000 ридов на миллион выровненных). Два мажорных кластера образцов оказались полностью согласованными с клинической характеристикой тканей.

Для исследования роли неточностей в работе ферментов Drosha и Dicer в здоровых и опухолевых тканях были составлены таблицы, содержащие информацию о суммарном количестве ридов на миллион выровненных по каждому образцу для каждого значения отступа от канонической формы микроРНК. Отступы с 5'-конца 5'-цепи микроРНК и с 3'-конца 3'-цепи микроРНК были отнесены к неточностям в работе Drosha, тогда как отступы с 3'-конца 5'-цепи и с 5'-конца 3'-цепи были отнесены к неточностям в работе Dicer. Построенные таблицы были разделены на две части, отвечающие за образцы здоровых тканей и за образцы опухолей. Далее значения каждой из таблиц были нормированы с целью приведения к процентной шкале.

Полученные данные отражены на рис. 2а, 2б (значения отступов приведены в направлении от концов к петле шпильки).

Рис. 2.

Количественные оценки неточностей работы в здоровых и опухолевых тканях фермента Drosha (а) и фермента Dicer (б). Вертикальные отрезки на концах столбиков обозначают стандартное отклонение.

Видно, что в целом внутриядерная обработка микроРНК ферментом Drosha проходит с меньшим процентом ошибок по сравнению с цитоплазматической обработкой ферментом Dicer. Также интерес представляет смещение неточностей работы Drosha в сторону петли шпильки на фоне смещенности отступов Dicer в сторону концов шпильки. Таким образом, оба фермента в основном работают на укорачивание молекулы микроРНК. Сравнение данных образцов здоровых и опухолевой тканей с помощью U-критерия Манна–Уитни показало, что в патологических клетках происходит существенное изменение частот в вариантах работы Drosha и Dicer. Так, статистически значимыми оказались различия в работе Drosha при значениях смещения 0, 1 и 3 (p-значения равны 4.69 × 10^–4, 4.69 × 10^–4 и 2.69 × 10^–3 соответственно) и в работе Dicer при значениях смещения –2, 1, 2 (p-значения равны 4.69 × 10^–4, 4.69 × 10^–4 и 6.79 × 10^–3 соответственно).

Таким образом, процесс образования изоформ микроРНК, связанный с деятельностью белков Drosha и Dicer, имеет значимые различия между здоровыми и опухолевыми тканями толстой кишки. Эти данные следует учитывать при исследовании роли микроРНК в регуляции функциональной активности здорового эпителия кишечника, в том числе везикулярного транспорта [14, 15], с использованием линейных клеток колоректальной аденокарциномы человека. При выборе и разработке методов обнаружения микроРНК, а также при анализе генов-мишеней данных микроРНК и изменения их экспрессии рекомендуется учитывать набор существующих изоформ микроРНК.