Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 395-399

Инсулин-зависимый сахарный диабет 1 типа (Д1Т) является спонтанным аутоиммунным заболеванием, которое вызывает патологические изменения многих органов и тканей человека. К сожалению, в мире растет число диагностированных случаев этого неизлечимого заболевания, которое поражает в основном молодых людей, включая детей. Основной мишенью этой патологии являются инсулин-продуцирующие бета-клетки поджелудочной железы, которые атакуются аутореактивными клонами Т лимфоцитов. Недостаток инсулина ведет к гипергликемии и, несмотря на ежедневные пожизненные инъекции инсулина, понижающие уровень глюкозы в крови, это заболевание вызывает многие осложнения [1].

Известно, что гипергликемия вызывает усиленную продукцию активных форм кислорода (ROS), что изменяет состояние клеточного статуса при диабете и вызывает каскад патологических последствий [2]. Положение усугубляется тем, что гипергликемия также снижает уровень эндогенной антиоксидантной системы защиты при сахарном диабете, включающую ферменты-антиоксиданты и низкомолекулярные соединения, обладающие антиоксидантной активностью [3].

В сравнении с другими клетками, бета-клетки поджелудочной железы характеризуются низким содержанием основных ферментов-антиоксидантов, включая супероксиддисмутазу, каталазу и глутатионпероксидазу, что определяет повышенную чувствительность панкреатических бета-клеток к окислительному стрессу [4, 5]. В ответ на повреждение бета-клетки инициируют “стрессовый” ответ, который, помимо других факторов, характеризуется быстрым увеличением определенного набора белков, известных как белки теплового шока (Hsp’s). Основными функциями белков теплового шока являются защита от апоптотических стимулов и предотвращение неправильного сворачивания и агрегации белка в стрессовых ситуациях, что указывает на анти-воспалительную функцию этих белков [6, 7]. Известно, что в условиях in vitro повышенная экспрессия Hsp70 может защищать бета-клетки поджелудочной железы от действия цитокина IL-1, а тепловой шок активирует защитные механизмы бета-клеток [8, 9].

В настоящей работе использовали две модели Д1Т. Во-первых, большую дозу аллоксана (500 мг/кг веса) вводили мышам-самцам линии Balb/C для индукции тяжелой формы развитого диабета, при этом фиксировали значительное повышение уровня глюкозы в крови уже на 5-й день после внутрибрюшинной инъекции аллоксана. Во-вторых, исследовали экспрессию белков теплового шока в условиях in vitro в культивируемых бета-клетках поджелудочной железы RIN-m5F. В качестве фермента-антиоксиданта использовали рекомбинантный белок пероксиредоксин 6 (PRDX6), который вводили мышам внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг за 15 мин до введения аллоксана, либо добавляли в среду культивирования клеток RIN-m5F в количестве 150 мкг/мл. Ранее мы доказали, что PRDX6 защищает бета-клетки RIN-m5F, культивируемые с высоким содержанием глюкозы, через механизм снижения уровня продукции ROS и уровня апоптоза [10]. Основной задачей настоящей работы было сравнительное исследование влияния PRDX6 на экспрессию индуцибельных форм двух белков теплового шока (Hsp70 и Hsp90α) в лимфоцитах селезенки мышей на 10-й день развития тяжелой формы диабета, характеризующейся высокой смертностью животных, что указывает на истощение защитного потенциала организма в этих условиях. С другой стороны, задачей работы было выяснение закономерностей экспрессии этих белков в условиях in vitro c использованием бета-клеток RIN-m5F.

Показали, что экспрессия индуцибельной формы белка Hsp70, Hsp72, при тяжелой форме диабета снизилась. Напротив, экспрессия белка теплового шока Hsp90α достоверно повышалась при развитом диабете первого типа (рис. 1).

Рис. 1.

Экспрессия белков теплового шока в лимфоцитах селезенки мышей с тяжелой формой аллоксан-индуцированного диабета 1 типа.

Наличие белков в образцах определяли методом Вестерн-блот анализа с использованием следующих первичных антител: поликлональных антител кролика к HSP90a (Enzo Life Sciences, США); поликлональных антител кролика к HSP70/HSP72 (Enzo Life Sciences, США); поликлональных антител кролика к GAPDH (Cell Signlliing, США). В качестве вторичных антител были использованы антитела козы к IgG кролика, конъюгированные с биотином (Имтек, Россия), а затем комплекс, содержащий стрептавидин и пероксидазу хрена (Sigma, США). Для выявления белков использовали систему ECL (“GE Healthcare”, Швеция). Детекция сигнала производилась с помощью хемилюминесцентного сканера C-DiGit (LI-COR Biosciences (США)), денситометрический анализ проводили с использованием Image Studio 4.0. В качестве контроля массы использовали маркеры молекулярного веса Spectra (Thermo FS, Швеция), для контроля специфичности – белки HSP90α и HSP70/HSP72 (Enzo Life Sciences, США). Показаны фотографии Вестерн-блот анализа для одного из трех независимых экспериментов (индивидуально от каждой из трех мышей в каждой группе), цифры под полосками – среднее значение количества белка после денситометрии блотов от трех экспериментов, показатели нормировали к соответствующему контролю нагрузки (GAPDH) и выражали в относительных единицах, статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента. * – Достоверное отличие от контроля; # – достоверное отличие от группы “диабет”.

Несмотря на доказанную защитную активность PRDX6 в условиях in vitro [10], применение этого фермента в условиях in vivo еще больше снизило экспрессию Hsp72 в лимфоидных клетках диабетных мышей. С другой стороны, тогда как экспрессия Hsp90α повышалась в лимфоцитах мышей с тяжелой формой диабета, применение PRDX6 приводило к уменьшению экспрессии этого белка ниже контрольного значения.

Для выяснения механизмов функционирования Hsp’s в условиях диабета изучали экспрессию Hsp70 и Hsp90α в бета-клетках инсулиномы крысы RIN-m5F, культивируемых в присутствии смеси цитокинов (15 ng/ml IL-1 и 30 ng/ml TNF-α) в течение 6 или 15 ч. Показали, что в присутствии цитокинов, которые моделировали аутоиммунную атаку на бета-клетки поджелудочной железы (основной фактор индукции Д1Т), экспрессия Hsp70 и Hsp90α повышалась, причем этот рост был заметнее при увеличении времени культивирования клеток RIN-m5F (рис. 2). При добавлении к клеткам PRDX6 этот эффект усиливался, особенно для Hsp70. Таким образом, можно полагать, что присутствие фермента-антиоксиданта стимулирует защитный ресурс бета-клеток, который реализуется, в том числе, через экспрессию Hsp’s.

Рис. 2.

Экспрессия белков теплового шока в клетках RIN-m5F, культивируемых в присутствии цитокинов (IL-1 и TNF-α) и PRDX6. Показаны фотографии Вестерн-блот анализа для одного из 3-х независимых экспериментов с использованием в каждом случае клеток из разных пассажей, цифры под полосками – среднее значение количества белков после денситометрии блотов от трех экспериментов, остальные пояснения, как на рис. 1. * – достоверное отличие от контроля; + – достоверное отличие от группы “цитокины”.

Результаты работы показали, что при тяжелой форме Д1Т, вызывающей 80% смертности животных в течение 1 мес., не индуцируется защитный ответ лимфоидных клеток, связанный с экспрессией Hsp70.

С другой стороны, экспрессия Hsp90α повышается в этих условиях. Можно предположить, что такие изменения связаны с различной функцией этих белков для защитной системы клетки.

Действительно, белок Hsp70 в обычных условиях присутствует в клетке только в следовых концентрациях, а экспрессируется исключительно при стрессе. Напротив, Hsp90α содержится в покоящихся клетках в достаточно больших концентрациях, при этом в стрессовых условиях он также активируется. Кроме того, известно, что субстратами для Hsp90α являются сигнальные белки, некоторые из которых активно продуцируются при диабете, как было показано нами раннее [11]. Исследования роли отдельных Т-клеточных популяций для формирования аутоиммунного воспаления, свойственного для Д1Т, позволили выявить особую функцию T_reg лимфоцитов, которые в кооперации с белками теплового шока регулируют противовоспалительную активность в условиях хронического воспаления [12, 13]. В нашей предыдущей работе сравнивали изменения иммунного статуса у мышей с аллоксан-индуцированном диабете на двух стадиях его развития – при пре-диабете и развитом диабете. Доказали, что для пре-диабета характерно снижение активности Th2 и T_reg популяций Т-клеток, но не Th1 лимфоцитов. Напротив, при развитом диабете наблюдали снижение активностей Th1 и T_reg, но не Th2 лимфоцитов [14]. Кроме того, экспрессия Hsp70 резко увеличивалась в условиях пре-диабета, тогда как при развитом диабете синтез этого белка был значительно подавлен. Другие закономерности были показаны для белка теплового шока Hsp90α. Экспрессия этого белка незначительно повышалась в условиях пре-диабета, но при развитом диабете наблюдали пик экспрессии Hsp90. С учетом этих сведений и на основании результатов настоящей работы можно сделать предположение о том, что вся сложная конфигурация вовлеченности белков теплового шока в реализацию аутоиммунных процессов при Д1Т находится в прямой зависимости от периода развития и степени тяжести этого хронического воспалительного процесса.

В заключение можно отметить, что при тяжелой форме сахарного диабета 1 типа, индуцированного аллоксаном, вызывающим окислительный стресс и гибель инсулин-продуцирующих бета-клеток, из двух исследованных белков теплового шока только Hsp90α формирует стрессовый про-воспалительный ответ. С другой стороны, инсулин-продуцирующие бета-клетки RIN-m5F демонстрируют защитную роль Hsp70 и Hsp90 в условиях, моделирующих Д1Т, при этом PRDX6 усиливает защитный потенциал этих шаперонов.