Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 493, № 1, стр. 408-412

Глиомы являются наиболее распространенными первичными опухолями головного мозга. Несмотря на использование современных подходов лечения, сочетающих хирургическую резекцию первичной опухолевой ткани, лучевую и химиотерапию, средняя выживаемость пациентов с глиомами составляет всего 12–15 месяцев [1]. Низкая эффективность терапии глиом обуславливает актуальность поиска новых молекулярных мишеней и разработку новых действующих на них соединений.

Одним из перспективных направлений для разработки новых противоопухолевых препаратов является регуляция работы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR), в особенности, подтипа, состоящего из пяти одинаковых α7 субъединиц (α7-nAChR) [2]. Рецепторы этого подтипа вовлечены в процессы регуляции пролиферации, миграции и апоптоза раковых клеток, а экспрессия гена CHRNA7, кодирующего α7 субъединицу nAChR, повышена в клетках карцином [2]. Кроме того, экспрессия гена CHRNA7 повышена в глиомах по сравнению с тканями здорового мозга человека [3]. Однако, участие nAChR в возникновении и развитии глиом изучено слабо.

SLURP-1 является секретируемым белком, экспрессирующимся в эпителии человека [4] и принадлежит семейству трехпетельных белков Ly6/uPAR [5]. Снижение экспрессии гена SLURP-1 наблюдается при карциномах толстой кишки [6] и легкого [7], в кератиноцитах человека при онкогенной трансформации, вызванной нитрозаминами NNK и NNN, содержащимися в табаке [8], а также в меланомах [9]. В то же время, повышенная концентрация эндогенного SLURP-1 в крови пациентов с раком поджелудочной железы коррелирует с большим временем жизни пациентов после хирургического удаления первичной опухоли [10]. Ранее нами было показано, что рекомбинантный аналог белка человека SLURP-1 (rSLURP-1) является селективным негативным аллостерическим модулятором α7-nAChR [11], подавляет рост клеток карцином кожи, кишечника и легкого [12, 13], а также снижает экспрессию α7-nAChR в раковых клетках [12].

В настоящей работе мы исследовали способность препарата rSLURP-1 ингибировать рост клеток модельных глиом U251 MG и А172 (НИИ Цитологии, Россия) (рис. 1). Для этого клетки глиом культивировали в среде IMDM и DMEM соответственно (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Hyclone, Великобритания). Влияние rSLURP-1 на число жизнеспособных клеток изучали при помощи теста на активность митохондриальной сукцинатдегидрогеназы (МТТ-тест). Для этого к клеткам добавляли МТТ (0.1 мг/лунка планшета) и инкубировали в течение 4 ч. МТТ восстанавливался до нерастворимого формазана, после чего кристаллы формазана растворяли в кислом изопропаноле. Активность митохондриальной сукцинатдегидрогеназы определяли по поглощению в лунках планшета при 540 нм с выравниванием фона при 650 нм на планшетном ридере Bio-Rad 680. Антипролиферативный эффект rSLURP-1 был также сопоставлен с эффектом α-бунгаротоксина (α-Bgtx), специфического ингибитора α7-nAChR. Для этого клетки высевали в 96-луночные планшеты (5 × 10³ клеток/лунка планшета), культивировали 24 ч, после чего добавляли 1 мкM α-Bgtx из стока в воде или 1 мкM rSLURP-1 из стока в 100% ДМСО и дополнительно инкубировали 24–96 ч. Конечная концентрация ДМСО не превышала 0.1% и не влияла на число жизнеспособных клеток, что было подтверждено дополнительными экспериментами. Каждые 24 ч среду в лунках планшета меняли на новую, содержащую те же количества веществ. Было показано, что при инкубации в течение 24 и 48 ч эффект rSLURP-1 на рост клеток U251 MG был незначительным. Однако более продолжительная инкубация клеток с rSLURP-1 в течение 72 ч приводила к снижению числа жизнеспособных клеток до ∼76% относительно контрольного уровня (рис. 1). Инкубация клеток А172 с rSLURP-1 сокращала число жизнеспособных клеток до ∼93, ∼78 и ∼73% от контрольного уровня при инкубации в течение 24, 48 и 72 ч соответственно (рис. 1). Эффект rSLURP-1 на пролиферацию клеток U251 MG и А172 был сопоставим с эффектом α-Bgtx (рис. 1).

Рис. 1.

Влияние α-Bgtx и rSLURP-1 на пролиферацию клеток глиом U251 MG и А172 при разном времени инкубации. Клетки инкубировали с 1 мкМ α-Bgtx и rSLURP-1 в течение 24–96 ч и анализировали влияние препаратов на количество жизнеспособных клеток при помощи МТТ-теста (n = 3–6). # (p < 0.05), ## (p < 0.01), ### (p < 0.001) и #### (p < 0.0001) означает достоверное отличие групп данных от контроля согласно одностороннему тесту ANOVA с последующим Dunnet’s/hoc тестом. 100% жизнеспособных клеток соответствует необработанным клеткам (контроль, пунктирная линия).

Для более детальной характеризации активности rSLURP-1 на клетках U251 MG и А172 были построены кривые доза-эффект при инкубации клеток с рекомбинантным белком в течение 72 ч (рис. 2а). Для клеток U251 MG полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС₅₀) составила 2.82 ± 0.20 нМ для rSLURP-1 и 0.24 ± 0.02 нМ для α-Bgtx (рис. 2а, табл. 1). Для клеток А172 ЕС₅₀ составила 8.9 ± 0.3 нМ и 1.3 ± 0.2 нМ для rSLURP-1 и α-Bgtx соответственно (рис. 2а, табл. 1). Таким образом, rSLURP-1 ингибирует пролиферацию клеток глиом с ЕС₅₀, лежащей в наномолярном диапазоне, но менее эффективно, чем α-Bgtx. Наблюдаемые различия в антипролиферативной активности rSLURP-1 и α-Bgtx могут объясняться тем, что токсин ингибирует ток через канал α7-nAChR с большей эффективностью, чем rSLURP-1, кроме того, α-Bgtx связывается с α7-nAChR необратимо [11]. Другим объяснением может быть активация различных внутриклеточных сигнальных путей под действием rSLURP-1 и α-Bgtx. Предполагается, что антипролиферативная активность rSLURP-1 может быть обусловлена регуляцией α7-nAChR не только по инотропному пути, связанному с открытием/закрытием канала рецептора, но и по метаботропному механизму [4, 12, 13].

Рис. 2.

Анализ антипролиферативного эффекта α-Bgtx и rSLURP-1 на клетках глиом U251 MG и А172 (а). Влияние различных концентраций α-Bgtx и rSLURP-1 на рост клеток U251 MG и А172. Клетки инкубировали 72 ч с различными концентрациями α-Bgtx или rSLURP-1, после чего определяли количество клеток МТТ-тестом (n = 3–6). (б). Влияние неспецифического ингибитора nAChR мекамиламина (Мес) на антипролиферативный эффект rSLURP-1 на клетках U251 MG (n = 3–6). # (p < 0.05) означает отличие групп данных от контроля согласно одностороннему тесту ANOVA с последующим Dunnet’s/hoc тестом. * (p < 0.05) означает отличие групп данных и “rSLURP-1” по одностороннему тесту ANOVA с последующим Dunnet’s/hoc тестом. 100% жизнеспособных клеток соответствует необработанным клеткам (контроль, пунктирная линия).

Чтобы подтвердить, что антипролиферативный эффект rSLURP-1 в клетках глиом опосредуется nAChR, мы использовали неспецифический ингибитор nAChR – мекамиламин (Mec). Для изучения влияния мекамиламина на антипролиферативный эффект rSLURP-1 клетки U251 MG прединкубировали с 1 мкМ мекамиламина в течение получаса, после чего добавляли к клеткам 1 мкМ rSLURP-1 и инкубировали дополнительно в течение 72 ч. Мекамиламин сам по себе существенно не влиял на рост клеток U251 MG, однако, при совместном применении с rSLURP-1 число жизнеспособных клеток значительно возрастало по сравнению с клетками, обработанными только rSLURP-1 (рис. 2б). Это подтверждает наше предположение о вовлечении nAChR в антипролиферативную активность rSLURP-1.

Поскольку rSLURP-1 селективно взаимодействует с α7-nAChR [11], и именно этот рецептор предполагается мишенью действия рекомбинантного белка в раковых клетках [12, 13], мы провели сравнительный анализ экспрессии генов CHRNA7 и SLURP1 в клетках глиомы U251 MG и нормальных астроцитах (рис. 3). Для этого из клеток U251 MG и нормальных астроцитов (Cell Applications, США) выделяли суммарную РНК при помощи реактива Extract RNA (Evrogen, Россия). РНК обрабатывали ДНКазой I (Sigma, США), очищали при помощи набора Clean RNA Standard (Evrogen) и синтезировали кДНК с помощью набора Mint c DNA synthesis kit (Evrogen). ПЦР в реальном времени с полученной кДНК и специфическими праймерами (табл. 2) проводили с помощью готового набора HSqPCRmix (Evrogen) на амплификаторе Roche Light Cycler 96. Данные анализировали при помощи программы Lightcycler SW. Экспрессию целевых генов нормировали на экспрессию генов домашнего хозяйства β-ACTIN, GPDH и RPL13a. Было обнаружено, что в клетках U251 MG экспрессия гена CHRNA7 повышена по сравнению с нормальными астроцитами (рис. 3). В то же время, нам не удалось выявить экспрессию гена SLURP1 ни в нормальных астроцитах, ни в клетках глиомы U251 MG (рис. 3), что согласуется с данными [3].

Рис. 3.

Сравнительный анализ экспрессии генов CHRNA7 и SLURP1 в клетках глиомы U251 MG и нормальных астроцитах по данным ПЦР в реальном времени. * означает достоверное отличие между группами данных согласно двустороннему t-тесту.

Интересно, что существенный антипролиферативный эффект rSLURP-1 на клетках карцином толстой кишки, кожи, груди и легкого был заметен уже после 24 ч инкубации с препаратом [12, 13]. Для раковых клеток кожи и легкого наблюдалась заметная секреция эндогенного SLURP-1 во внеклеточное пространство уже после 1 ч инкубации с рекомбинантным препаратом, что, вероятно, приводит к значительному локальному увеличению концентрации SLURP-1 и межклеточной ауто/паракринной сигнализации [12, 13]. Можно предположить, что замедленный эффект действия rSLURP-1 на клетках глиом, наблюдающийся только после 48 ч, связан с отсутствием экспрессии эндогенного SLURP-1, и как следствие невозможностью быстро увеличить концентрацию SLURP-1 во внеклеточном пространстве. Вероятно, отсроченный эффект rSLURP-1 на клетках глиом скорее связан не с прямым взаимодействием рекомбинантного белка с рецептором, а с изменениями в экспрессии различных регуляторных молекул, вовлеченных в контроль клеточной пролиферации. Эти изменения могут происходить в результате активации различных внутриклеточных сигнальных каскадов в несколько этапов, как это было показано для другого Ly6/uPAR белка человека Lynx1 [14].

Таким образом, в настоящей работе впервые показано, что rSLURP-1 в наномолярных концентрациях ингибирует рост клеток глиом U251 MG и А172, и установлено, что активность рекомбинантного белка связана с nAChR. Полученные данные указывают на необходимость дальнейших исследований антипролиферативного действия rSLURP-1 и перспективность разработки препаратов на основе этого белка для терапии глиом.