Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 537-540

Физиологические функции высокомолекулярного растворимого белка мультимерина-1 (Mmrn-1), известного так же под названием эластинового микрофибриллярного интерфейсера 4 (elastin microfibril interfacer 4 – EMILIN-4), до конца не исследованы. Описанная у мышей линии C57BL/6J-OlaHsd спонтанная делеция генетического локуса, в котором располагается ген, кодирующий Mmrn-1, не ведет к выраженному фенотипу, из чего следует, что его отсутствие может быть компенсировано в процессе эмбрионального развития [1]. Однако детальный анализ методом микрокомпьютерной томографии (μCT) костных тканей C57BL/6J-OlaHsd мышей выявил снижение массы губчатого вещества эпифизов трубчатых костей, а гистологическое исследование клеточного состава костей показало повышенное содержание остеобластов при снижении их минерализации [2]. Это наблюдение и тот факт, что уровень экспрессии гена Mmrn-1 в костных тканях достаточно высок, явилось основанием для исследования его участия в метаболических процессах в остеобластах и формировании костей. В большом количестве белок Mmrn-1 содержится так же в эндотелии кровеносных сосудов и в альфа-гранулах тромбоцитов. Он синтезируется на достаточно высоком уровне в мегакариоцитах и был выявлен на поверхности активированных тромбоцитов в комплексе с фактором фон Виллебранда [3].

У мышей с делецией локуса Mmrn-1 обнаружены изменения в системе гемостаза, в частности, нарушение агрегации тромбоцитов и формирования тромба, а добавление мультимерина в in vitro экспериментах нивелировало эти нарушения [4]. В плазме крови Mmrn-1 не детектируется рутинными методами, но повышение его содержания в клеточной фракции крови больных острым миелоидным лейкозом (acute myelogenous leukemia AML) коррелирует с низким шансом ремиссии, более высоким риском рецидива заболевания и плохой выживаемостью пациентов [5].

Исследования нарушения функции Mmrn-1 в экспериментальных животных выполнены в основном с использованием линии мышей C57BL/6J-OlaHsd [6]. В геноме этой линии мышей спонтанная делеция протяженного участка размером 350 т.п.н. [1] включает помимо гена альфа-синуклеина (Snca), еще и Mmrn-1 поскольку эти гены расположены в непосредственной близости (около 160 т.п.н.) один от другого. Поскольку белку а-синуклеину (a-syn), являющемуся важным компонентом телец Леви, отводится важная роль в патогенезе болезни Паркинсона, было независимо создано несколько линий мышей с генетическими модификациями локуса Snca [7].

Нельзя исключить влияния вносимых модификаций на прилежащие области генома. В данной работе нами было проведено сравнительное исследование уровней экспрессии Mmrn-1 в трех линиях мышей с делецией Snca: B6;129X1-Snca^tm1Rosl/J [AbKO] полученной из лаборатории A. Rosental [8], B6;129-Snca^tm1Sud/J [ТаКО], полученной из лаборатории T. Sudhof [9] и B6(Cg)-Snca^tm1.2Vlb/J [delta flox KO], полученной из лаборатории V. Buchman [10, 11].

Чтобы выяснить, могут ли различные модификации Snca локуса влиять на экспрессию гена Мmrn-1, расположенного всего в 160 Kb от Snca, нами было исследовано содержание мРНК Mmrn-1 в коре головного мозга методом ОТ-PCR в реальном времени.

Из тканей коры головного мозга самцов в возрасте 3 месяцев выделяли тотальную РНК с помощью наборов RNeasy Plus Mini (Qiagen, Германия) по инструкции производителя. 2 мкг полученной РНК использовали для синтеза комплементарной цепи ДНК в реакции обратной транскрипции и последующей амплификации реагентами qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) по протоколу производителя в режиме реального времени в установке BioRad CFX 96 (BioRad, США). Использовали праймеры: Mmrn1-for: 5'-GGACACTGGCTCTCATTTAC-3' и Mmrn1-rev: 5'-CAGCATTGGATGTCTTCTGAG-3'. В качестве референсного гена внутреннего контроля использовали глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАФДГ) мыши. Последовательности праймеров:

q_m_GAPDH_for: 5'-CACTGAGCATCTCCCTCACA-3' и

q_m_GAPDH_rev: 5'-GTGGGTGCAGCGAACTTTAT-3'.

Проведенный анализ относительных уровней экспрессии Mmrn-1 в трех линиях мышей с генетическим нокаутом Snca показал, что его уровень был повышен в 35 раз у мышей линии AbKO, в то время как у delta flox KO и TaKO мышей он практически не отличался от уровня экспрессии Mmrn-1 в коре головного мозга контрольных дикого типа (рис. 1). Технология конструирования исследованных нокаутных линий включала использование эмбриональных стволовых клеток на стадии гомологической рекомбинации альфа-синуклеинового локуса с последующей селекцией клонов по продукции введенного в составе таргетной кассеты бактериального гена neo. При этом непосредственные модификации прилежащих к гену Snca последовательностей различались (рис. 2). Так, в линии AbKO после удаления второго и третьего экзонов альфа-синуклеина с прилегающими последовательностями (размер делеции порядка 3.2 Kb) в модифицированном локусе оставался фрагмент плазмидного вектора pGT-N39 размером 1.9 Kb, содержащий кодирующую часть гена neo под промотором мышиного гена фосфоглицераткиназы Pgk1 (рис. 2). В нокаутной линии ТаКО так же удалены второй и третий экзоны Snca с прилегающими участками, и общий размер делеции составил 3.9 Kb. Оставшаяся в модифицированном локусе генома посторонняя последовательность включала фрагмент плазмиды pTK-Neo3A, содержащий ген neo под промотором мышиного гена субъединицы A полимеразы II Polr2a (рис. 2).

Рис. 1.

Сравнительный анализ уровней экспрессии гена Mmrn-1 в трех линиях мышей с генетическим нокаутом альфа-синуклеина. Содержание мРНК для  Mmrn-1 определено методом количественного ОТ-ПЦР в реальном времени в тканях коры головного мозга мышей B6;129X1-Snca^tm1Rosl/J (АbКО), B6;129-Snca^tm1Sud/J (ТаКО), B6(Cg)-Snca^tm1.2Vlb/J (delta flox KO) и контрольных мышей дикого типа (WT). M ± SEM, n = 6 для каждой группы; ** p < 0.01 при сравнении AbKO с остальными группами. One-way ANOVA Tukey’s multiple comparisons test.

Рис. 2.

Схема модификаций локуса Snca гена в нокаутных линиях мышей. Закрашены привнесенные в мышиный геном посторонние последовательности: ген neo, LoxP сайт и промоторы генов фосфоглицераткиназы (Pgk1) и субъединицы A полимеразы II (Polr2a). Стрелками указано направление транскрипции.

Важно отметить, что ориентации neo кассеты в геномах AbKO и ТаКО линий различались. В случае AbKO ген neo расположен дистальнее гена Snca и ориентирован в обратном направлении по отношению к модифицированному гену. В геноме ТаКО мышей промотор кассеты neo лежит проксимальнее по отношению к промотору Snca и ориентирован в том же направлении (рис. 2). В третьей анализированной нами линии – delta flox KO – делеция Snca гена была проведена с минимальными модификациями локуса. Из генома мыши был удален третий экзон, содержащий START-кодон, и небольшой участок прилегающей интронной последовательности размером всего 1.1 Kb, что существенно меньше, чем в линиях AbKO и ТаКО. Более того, и ген neo, и все значимые посторонние последовательности были удалены из модифицированного локуса полученных мышей. Единственной привнесенной вставкой, оставшейся в геноме delta flox KO мышей, является лишь LoxP сайт размером 34 bp (рис. 2).

Эти данные указывают на то, что функционально активный промотор pGT-N39 кассеты в геноме линии AbKO [8], ориентированный в направлении Mmrn-1, мог оказывать активирующий эффект на регуляторные последовательности этого гена. А ориентированный в обратном от гена Mmrn-1 направлении промотор из вектора pTK-Neo3A в конструкции ТаKO [9] обладал существенно меньшим воздействием на экспрессию гена Mmrn-1. В новой же нокаутной линии delta flox KO [10, 11] экспрессия гена Mmrn-1 практически не отличалась от экспрессии в немодифицированном геноме мышей дикого типа на том же генетическом фоне (рис. 1).

Биоинформационный анализ показал, что потенциальные регуляторные последовательности располагаются между генами Snca и Mmrn-1, а также в интронах Mmrn-1. В частности, между генами находятся два промотор-фланкирующих домена, а внутри Mmrn-1 есть два энхансера и два сайта связывания репрессора транскрипции CTCF, который вовлечен в регуляцию архитектуры хроматина и является разграничителем между эу- и гетерохраматином [12].

Полученные данные позволяют с высокой степенью вероятности предположить, что именно нарушения в работе регуляторных элементов генома являются причиной измененной экспрессии Mmrn-1 у AbKO мышей.

Несмотря на то, что нокаутная линия мышей AbKO (B6;129X1-Snca^tm1Rosl/J) широко используется в лабораториях мира для исследования нейродегенерации, подробный анализ уровня экспрессии Mmrn-1 ранее выполнен не был.

Работы с животными проводили в соответствии с приказом Минздрава России от 01 апреля 2016 г. № 199н “Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики”.