Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 532-536

Ядрышко является ключевой клеточной органеллой, служащей для образования рибосом. Как правило, в опухолевых клетках ядрышки обладают повышенной функциональной активностью, которая позволяет обеспечить более высокие потребности пролиферирующих клеток в синтезе белка. Хорошо известно, что активация ядрышек сопровождается увеличением их размеров и содержания в них белков [1, 2]. Эти фенотипические особенности ядрышек используются в клинической практике для оценки пролиферативного потенциала злокачественно трансформированных клеток [3]. На сегодняшний день основным маркером пролиферации клеток человека является ядрышковый белок Кi-67, известные функции которого связаны с биогенезом рибосом и организацией хроматина и который, по не выясненным пока причинам, в основном маркирует клетки на стадии репликации ДНК, т.е., в S-фазе клеточного цикла [4]. Однако развитие персонифицированной медицины и необходимость более точной диагностики опухолей разной этиологии требуют поиска дополнительных активационных маркеров опухолевых клеток. В онкогематологии в качестве таких маркеров были предложены ядрышковые белки NPM1 (В23, нуклеофозмин) и нуклеолин (С23). Однако в отличие от Ki-67, эти белки присутствуют в ядрышках не только опухолевых, но и многих нормальных клеток, что затрудняет оценку пула патологических лимфоцитов традиционными методами микроскопического анализа [5, 6].

Белок SURF6 млекопитающих – это жизненно необходимый ядрышковый фактор процессинга рРНК, повышенное содержание которого активирует клеточную пролиферацию [7–9]. Интересно, что дрожжевой гомолог SURF6, белок Rrp14, помимо участия в биогенезе рибосом влияет на способность дрожжевых клеток к делению, хотя молекулярные механизмы этого влияния остаются невыясненными [10, 11]. Неупорядоченная первичная структура и высокий позитивный заряд молекулы SURF6 способствуют его взаимодействию с NPM1, что, по мнению некоторых авторов, является ключевым условием формирования и функционирования ядрышка и его отдельных субдоментов [12, 13]. Поэтому можно ожидать, что содержание SURF6 будет изменяться при активации, бласттрансформации и дедифференцировке клеток. С целью проверки этого предположения, мы изучили содержания SURF6 на иммуноцитохимическом уровне и иммуноблотах с использованием двух специфических антител [14, 15] в лимфоцитах человека разных типов: нормальных, или покоящихся, активированных к пролиферации фитогемагглютинином (ФГА) in vitro, и нативных лимфоцитах, полученных от больных лимфопролиферативными заболеваниями (ЛПЗ). Полученные результаты впервые показали, что при определенных условиях белок ядрышка SURF6 не выявляется в нормальных лимфоцитах, но обнаруживается в активированных лимфоцитах, а также в лимфоцитах больных ЛПЗ, т.е. может служить новым активационным маркером лимфоцитов.

Лимфоциты выделяли из периферической крови по стандартной методике. Их активацию ФГА, иммуноцитохимическое окрашивание и проточную цитофлуориметрию производили, как описано нами ранее [5, 7, 9]. При постановке иммуноблотов на каждую дорожку наносили лизаты из примерно 5 × 10⁵ клеток в стандартном буфере Лэммли. После переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану (диаметр пор 0.22 мкм), ее инкубировали с поликлональными кроличьими [14] или моноклональными мышиными [15] антителами к SURF6 человека. Контролем нагрузки (loading control) служили моноклональные мышиные антителами к актину (“Merck”, Германия; каталожный номер MAB1501R). Мембрану инкубировали с антителами к иммуноглобулинам кролика или мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (“Merck”; каталожный номер AC111P). Во всех экспериментах антитела разводили в буфере TBS-T (20 мM Трис-HCl, 150 мM NaCl, 0.05% Твин-20, pH 7.6) до одинаковых рабочих концентраций; окрашивание длилось 1 ч при комнатной температуре. Места связывания антител выявляли с помощью набора Pierce ECL Western Blotting Substrate (“Thermo Fisher Scintific”, США, каталожный номер 32209) и рентгеновской пленки HyperFilm ECL (“Amersham Pharmacia Biotech”, Великобритания, GE28-9068-37), следуя рекомендациям производителя. Окраску на Ki-67 производили согласно [2]. Иммортализованные клетки Т-лимфобластной лейкемии человека линии Jurkat выращивали, следуя рекомендациям поставщика (“БиолоТ”, Санкт-Петербург), и использовали в качестве контроля. Всего нами были изучены нативные лимфоциты, полученные от восьми практически здоровых доноров и пяти больных ЛПЗ, образцы которых были предоставлены ФГБУ “НМИЦ гематологии” Минздрава России.

На рис. 1а, б представлены типичные варианты иммуноцитохимического окрашивания лимфоцитов периферической крови доноров антителами к SURF6 [15] до активации (а) и через 48 ч после активации ФГА (б). На рис. 1в показана окраска антителом к SURF6 [14] лимфоцитов больного с диагнозом мантийная зона селезенки. Видно, что антитела не окрашивают ядрышки в покоящихся лимфоцитах (а), но отчетливо метят ядрышки в активированных лимфоцитах (б), а также в лимфоцитах больного ЛПЗ (в). Более того, использованные антитела метили ядрышки лимфоцитов в образцах периферической крови всех онкобольных, случайным образом отобранных для анализа. Однако в зависимости от диагноза число SURF6-позитивных лимфоцитов у пациентов варьировало от 10% до 60% (табл. 1). Из таблицы также видно, что у всех больных число SURF6-позитивных лимфоцитов превышает число Ki-67-позитивных лимфоцитов, хотя между этими двумя параметрами наблюдается прямая корреляция. Эти наблюдения свидетельствуют в пользу того, что число SURF6-позитивных лимфоцитов у больных ЛПЗ отражает агрессивность течения заболевания, традиционно определяемую по числу Ki-67-позитивных лимфоцитов.

Рис. 1.

Иммуноцитохимическое окрашивание антителами к SURF6 лимфоцитов периферической крови донора до активации (а), лимфоцитов донора через 48 ч после активации ФГА (б) и лимфоцитов больного ЛПЗ с диагнозом лимфома майтийной зоны селезенки (в). Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия – 20 мкм.

Сходные результаты были получены при анализе содержаний SURF6 на иммуноблотах (рис. 2). На рисунке 2 видно, что в идентичных условиях SURF6 не выявляется в нормальных лимфоцитах (дорожка 0 ч), но прекрасно виден в клетках Jurkat, активированных лимфоцитах (дорожка 48 ч), а также в лимфоцитах больных ЛПЗ (дорожки 1–5).

Рис. 2.

Содержание белка SURF6 на иммуноблотах лимфоцитов периферической крови донора до активации (дорожка 0 ч), лимфоцитов донора через 48 ч после активации ФГА (дорожка 48 ч) и лимфоцитов больных ЛПЗ (дорожки 1–5), где 1 – лимфома мантийной зоны селезенки, 2 – хронический лимфолейкоз на начальной стадии, 3 – волосатоклеточный лейкоз, 4 – хронический лимфолейкоз на прогрессирующей стадии, 5 – лимфома маргинальной зоны селезенки. На крайней дорожке слева показано положение SURF6 клетках линии Jurkat. Актин использовали в качестве контроля нагрузки. На все дорожки нанесены лизаты из примерно 5×10⁵ лимфоцитов.

Также, как и при иммуноцитохимическом окрашивании, на иммуноблотах содержание SURF6 у больных коррелировало с числом Ki-67 позитивных лимфоцитов (рис. 2). При визуальной оценке, наиболее высокое содержание SURF6 наблюдалось в лимфоцитах больного лимфомой мантийной зоны селезенки (дорожка 1; 13% Ki-67+ лимфоцитов) и более низкое – при хроническом лимфолейкозе (дорожка 2; 2% Ki-67+ лимфоцитов). Следует подчеркнуть, что окрашивание образцов разными антителами к SURF6 [14, 15] приводило к одинаковым результатам – в лизатах нормальных лимфоцитов SURF6 не выявлялся, а в лизатах лимфоцитов больных или активированных лимфоцитов его визуализация не представляла труда.

Таким образом, двумя методами – иммунофлуоресценцией и на иммуноблотах и с использованием двух специфических антител мы показали, что проявление SURF6 в ядрышках является признаком бластной трансформации лимфоцитов. Существенным преимуществом SURF6 перед другими ядрышковым белками – потенциальными активационными маркерами лимфоцитов человека [5], является его более низкий уровень экспрессии в нормальных клетках, что облегчает идентификацию патологических, т.е. SURF6-позитивных, лимфоцитов в образцах пациентов с ЛПЗ. Выявление SURF6 в сыворотке крови может быть использовано для ранней (дооперационной) диагностики онкологических заболеваний, особенно при труднодоступности опухоли или отсутствии ее клинических проявлений.

В дополнительные материалы включены два рисунка (рис. 3 и рис. 4).

Рис. 3.

Факс-анализ распределения нормальных лимфоцитов по основным фазам клеточного цикла (G0, G0/G1, S и G2/M) до активации (а) и через 48 ч после активации ФГА (б); (в) – график, отображающий число лимфоцитов в S-фазе на разные сроки ФГА-активации. На (а, б) вертикальные оси – число клеток, горизонтальные оси – содержание ДНК, где n – гаплоидное содержание ДНК. На (в) вертикальная ось – число клеток в S-периоде (в %), горизонтальная ось – время после ФГА-активации (в часах). Указаны средние значения и стандартные ошибки определения средних значений

Рис. 4.

Содержание белка SURF6 на иммуноблотах в лимфоцитах четырех доноров до ФГА-активации (дорожки 0 ч), через 48 часов после ФГА-активации (дорожки 48 ч). На крайней дорожке справа показано положение SURF6 клетках линии Jurkat. Актин использовали в качестве контроля нагрузки. На все дорожки нанесены лизаты из примерно 5×10⁵ лимфоцитов. Блот проявлен моноклональными антителами к SURF6 человека [15].

Рис. 3 характеризует распределение донорских лимфоцитов по основным фазам клеточного цикла в контроле (без активации) и после активации ФГА.

На рис. 4 показаны иммуноблоты лимфоцитов четырех доноров до и через 48 ч после активации.