1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 494, № 1, 2020

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 486-490

Дипептидные миметики отдельных петель NGF и BDNF активируют PLC-γ1

член-корреспондент РАН Т. А. Гудашева 1, *, И. О. Логвинов 1, С. В. Николаев 1, Т. А. Антипова 1, П. Ю. Поварнина 1, академик РАН С. Б. Середенин 1

1 Научно-исследовательский институт фармакологии имени В. В. Закусова
Москва, Россия

* E-mail: tata-sosnovka@mail.ru

Поступила в редакцию 20.04.2020
После доработки 23.04.2020
Принята к публикации 23.04.2020

Полный текст (PDF)

Аннотация

Ранее нами были сконструированы и синтезированы дипептидные миметики отдельных петель фактора роста нервов (NGF) и мозгового нейротрофического фактора (BDNF). Было установлено, что они активируют соответствующие тирозинкиназные (Trk) рецепторы и имеют разную картину активации пострецепторных сигнальных путей PI3K/AKT и MAPK/ERK в экспериментах in vitro. В настоящем исследовании на клетках HT-22 показано, что все эти соединения активируют каскад фосфолипазы С-γ1(PLC-γ1).

Ключевые слова: BDNF, NGF, дипептидные миметики, PI3K/AKT, MAPK/ERK, PLC-γ1

Нейротрофины это группа близкородственных белков из семейства ростовых факторов, которые регулируют формирование и важнейшие функции центральной нервной системы, включая клеточную миграцию, рост нейритов, синаптогенез, выживаемость и гибель клеток, нейрональную трансмиссию и синаптическую пластичность [1–3].

Связываясь с тирозинкиназными (Trk) рецепторами, нейротрофины вызывают последовательно их гомодимеризацию, аутофосфорилирование и запуск пострецепторных сигнальных путей – PI3K/AKT, MAPK/ERK и PLC-γ1 [4, 5]. Имеются данные в пользу ключевой роли в активации MAPK/ERK и PI3K/AKT фосфорилирования Tyr490 (нумерация по hTrkA) и последующего рекрутирования адаптерных белков Shc и Frs 2 [4]. Активация пути PLC-γ1 инициируется непосредственным связыванием самой фосфолипазы с фосфорилированным Tyr783.

Нейротрофины представляют собой гомодимерные белки, каждый мономер которых имеет 4 выступающие наружу петли [6, 7]. В НИИ фармакологии имени В. В. Закусова была высказана гипотезао том, что разные петлеобразные структуры нейротрофинов отвечают за их разные биологические функции, по-разному активируя пострецепторные сигнальные пути [8]. Для проверки этой гипотезы были получены миметики отдельных петель нейротрофинов, фактора роста нервов (NGF) и мозгового нейротрофического фактора (BDNF): для 1-й и 4-й петель NGF ГК-6 и ГК-2 [8]; для 1, 2 и 4-й петель BDNF ГСБ-214, ГТС-201 и ГСБ-106 [9] соответственно (см. табл. 1). [Патент РФ №2410392, 2010; Патент США US 9,683,014 B2, 2017; Патент Европейского патентного ведомства EP 2397488, 2019; Патент КНР CN 102365294 B, 2016]. При конструировании сохраняли наиболее экспонированный дипептидный фрагмент бета-изгибов петель, предшествующий аминокислотный остаток заменяли его биоизостером. Для воспроизводства димерной структуры нейротрофина проводили димеризацию по С-концу с помощью олигометилендиамидного спейсера.

Таблица 1.

Дипептидные миметики отдельных петель NGF и BDNF обладают разными паттернами активации PI3K/AKT и MAPK/ERK [10, 11]

Активация сигнальных каскадов Trk рецепторов Миметики
NGF BDNF
1 петля 4 петля 1 петля 2 петля 4 петля
ГК-6 ГК-2 ГСБ-214 ГТС-201 ГСБ-106
PI3K/AKT + + + – +
MAPK/ERK + – – + +

ГК-6, гексаметилендиамид бис(N-аминогексаноил-глицил-L-лизина); ГК-2, гексаметилендиамид бис(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина); ГСБ-214, гептаметилендиамид бис(N-моносукцинил-L-метионил-L-серина); ГТС-201, гексаметилендиамид бис(N-гексаноил-L-серил-L-лизина); ГСБ-106, гексаметилендиамид бис(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина)

С использованием Вестерн-блот анализа на культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши НТ-22 было показано, что все полученные нами дипептидные миметики NGF и BDNF активируют соответственно TrkA и TrkB рецепторы [10, 11]. При этом дипептиды, в соответствии с выдвинутой гипотезой, обладали разными паттернами активации пострецепторных путей трансдукции сигнала, PI3K/AKT и MAPK/ERK (табл. 1) и разной фармакологической активностью. Миметик 4-й петли NGF (ГК-2) и миметик 1-й петли BDNF (ГСБ-214) активировали только AKT, а миметик 2-й петли BDNF (ГТС-201) – ERK. Миметики 1-й петли NGF (ГК-6) и 4-й петли BDNF (ГСБ-106) активировали оба пути. Все миметики, активирующие АКТ, обладали нейропротекторной и антидиабетической активностью. Миметики, активирующие ERK, модулировали болевую чувствительность. Миметики, активирующие оба  пути, обладали антидепрессивной активностью [12].

Для дальнейшего изучения влияния петлеобразных структур нейротрофинов на пострецепторные сигнальные пути в настоящей работе нами исследовано влияние дипептидных миметиков отдельных петель NGF и BDNF на активацию третьего пострецепторного сигнального пути Trk рецепторов, PLC-γ1.

Методом Вестерн-блоттинга определено фосфорилирование PLC-γ1 после внесения миметиков NGF дипептидов ГК-6 (10–6 М) и ГК-2 (10–8 М) и миметиков BDNF дипептидов ГСБ-214 (10–6 M), ГТС-201 (10–7 M), ГСБ-106 (10–6 M) в культуру гиппокампальных клеток линии НТ-22. Использованы моноклональные антитела к фосфорилированной по Tyr783 PLC-γ1 и поликлональные – к общей фосфолипазе PLC-γ1. Пробы отбирались через 5, 15, 30, 60, 180 мин. Временные интервалы выбраны на основании данных по фосфорилированию Trk, AKT и ERK в присутствии дипептидных миметиков [10, 11]. Концентрации дипептидов соответствовали наиболее активным при изучении нейропротективных эффектов in vitro. В качестве положительных контролей использовали NGF и BDNF в концентрации 10–9 М.

Оба миметика NGF, подобно полноразмерному нейротрофину, активировали PLC-γ1 (рис. 1). Статистически значимое увеличение фосфорилирования PLC-γ1 наблюдалось через 5, 15, 30, 60 мин, а для ГК-2 от 15 до 180 мин после внесения в культуральную среду. Иммунореактивность к фосфорилированной PLC-γ1 была повышена в обработанных нейронах по сравнению с контролем через 5 мин после внесения NGF (177 ± 2%, p = 0.03), ГК-6 (163 ± 5%, p = 0.02); через 15 мин после внесения NGF (170 ± 7%, p = 0.03), ГК-2 (138 ± 11%, p = 0.03), ГК-6 (166 ± 5%, p = 0.02); через 30 мин после внесения NGF (182 ± 15%, p = = 0.03), ГК-2 (165 ± 11%, p = 0.02), ГК-6 (153 ± 6%, p = 0.03); через 60 мин после внесения NGF (190 ± 20%, p = 0.03), ГК-2 (185 ± 17%, p = 0.03), ГК-6 (159 ± 9%, p = 0.03); через 180 мин после внесения ГК-2 (173 ± 16%, p = 0.03) в культуральную среду.

Рис. 1.

Влияние NGF (100 нг/мл), ГК-6 (10–6 М) и ГК-2 (10–8 М) на фосфорилирование PLC-γ1 в культуре гиппокампальных нейронов НТ-22. (а) Репрезентативные Вестерн-блоты белка p-PLCγ (Tyr783) и PLCγ. (б) Результаты денситометрического анализа в % от контроля (± стандартное отклонение). PLCγ = общая PLCγ. Представленные данные являются средними значениями из трех независимых экспериментов. * – р ≤ 0.05 относительно контроля (критерий Манна–Уитни).

Исследованные миметики BDNF, как и нейротрофин, статистически значимо увеличивали фосфорилирование PLC-γ1 (рис. 2).

Рис. 2.

Влияние BDNF, ГСБ-214 (10–6 M), ГТС-201 (10–7 M) и ГСБ-106 (10–6 M) на фосфорилирование PLC-γ1 в культуре гиппокампальных нейронов линии НТ-22. (а) Репрезентативные Вестерн-блоты белка p-PLCγ (Tyr783) и PLCγ. (б) Результаты денситометрического анализа в % от контроля (± стандартное отклонение). PLCγ = общая PLCγ. Представленные данные являются средними значениями из трех независимых экспериментов. * – p ≤ 0.05 относительно контроля (критерий Манна–Уитни).

Уровень фосфорилированной PLC-γ1 по сравнению с контролем значительно увеличивался через 5 мин после добавления в инкубационную среду BDNF (185.5 ± 5.3%, p = 0.03), ГСБ-214 (174.3 ± 1.6%, p = 0.03), ГТС-201 (183.1 ± 1.2%, p = = 0.03), ГСБ-106 (180.4 ± 5.2%, p = 0.03). Через 15 мин достоверное увеличение фосфорилирования PLC-γ1 наблюдалось только у ГСБ-106 (144.2 ± 16.7%, p = 0.03). В остальных временных точках статистически значимых различий фосфорилирования PLC-γ1 по сравнению с контролем не обнаружено.

Следует отметить, что активация PLC-γ1 как дипептидными миметиками, так и полноразмерными белками наступает быстро, за 5 мин и менее (не показано), при этом активированное под действием NGF состояние сохраняется дольше, чем под действием BDNF (см. рис. 1 и 2), что соответствует литературным данным [13–15].

Таким образом, дипептидные миметики отдельных петель NGF и BDNF активируют PLC- γ1 независимо от паттерна активации AKT и MAPK. Это предположительно можно объяснить тем, что PLC-γ1 – сигналинг инициируется благодаря непосредственному связыванию самого энзима с фосфорилированным Tyr783 (нумерация по hTrkA) тирозинкиназного рецептора, и эта инициация не зависит от других белков. В то же время активация AKT и MAPK идет через ряд стадий, начиная с набора активированным Tyr490 адаптерных белков. Последнее допускает формирование различий пострецепторных эффектов соединений, имитирующих различные участки нейротрофинов, на этапе сопряжения фосфорилирования тирозина рецептора и связывания адаптерных белков. Подтверждение этой гипотезы требует дополнительных экспериментальных исследований.

Список литературы

  1. LeWin G.R., Barde Y.-A. Physiology of neurotrophins // Annu Rev Neurosci. 1996. V. 19. P. 289–317.

  2. Kaplan D.R., Miller F.D. Neurotrophin Signal Transduction in the Nervous System // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. V. 10. P. 381–391.

  3. Segal R.A. Selectivity in Neurotrophin Signaling: Theme and Variations // Annu. Rev. Neurosci. 2003. V. 26. P. 299–330.

  4. Huang E.J., Reichardt L.F. Trk Receptors: Roles in Neuronal Signal Transduction //Annu. Rev. Biochem. 2003. V. 72. P. 609–642.

  5. Reichardt L.F. Neurotrophin-regulated signalling pathways // Philosophical Transactions of the Royal Society B. 2006. V. 361. № 1473. P. 1545–1564.

  6. McDonald N.Q., Lapatto R., Murray-Rust J., et al. New protein fold revealed by a 2.3-Å resolution crystal structure of nerve growth factor // Nature. 1991. V. 354. P. 411–414.

  7. Robinson R.C., Radziejewski C., Spraggon G., et al. The structures of the neurotrophin 4 homodimer and the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 4 heterodimer reveal a common Trk-binding site // Protein Sci. 1999 V. 8. P. 2589–2597.

  8. Gudasheva T.A., Antipova T.A., Seredenin S.B. Novel low-molecular-weight mimetics of the nerve growth factor // Dokl. Biochem. Biophys. 2010. V. 434. P. 262–265.

  9. Gudasheva T.A., Tarasyuk A.V., Pomogaibo S.V., et al. Design and synthesis of dipeptide mimetics of the brain-derived neurotrophic factor // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2012. V. 38. № 3. P. 243–252.

  10. Gudasheva T.A., Povarnina P.Y., Antipova T.A. et al. Dimeric dipeptide mimetics of the nerve growth factor Loop 4 and Loop 1 activate TRKA with different patterns of intracellular signal transduction // J. Biomed. Sci. 2015. V. 22. № 5. P. 106.

  11. Gudasheva T.A., Povarnina P.Y, Logvinov I.O. et al. Mimetics of brain-derived neurotrophic factor loops 1 and 4 are active in a model of ischemic stroke in rats // Drug Des. Devel. Ther. 2016. V. 10. P. 3545–3553.

  12. Gudasheva T.A., Logvinov I.O., Povarnina P.Y., et al. Analysis of dependence of antidepressant properties of TrkB receptor ligands on MAP-kinase pathway activation // Dokl. Biochem. Biophys. 2015. V. 460. P. 20–22.

  13. Widmer H.R., Kaplan D.R., Rabin S.J., et al. Rapid phosphorylation of phospholipase Cγ1 by brain derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 in cultures of embryonic rat cortical neurons // J. Neurochem. 1993. V. 60. P. 2111–2123.

  14. Vetter M.L., Martin-Zanga D., Parada L.F., et al. Nerve growth factor rapidly stimulates tyrosine phosphorylation of phospholipase C-γl by a kinase activity associated with the product of the trk protooncogene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 5650–5654.

  15. York R.D, Molliver D.C, Grewal S.S., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase and endocytosis in nerve growth factor-induced extracellular signal-regulated kinase activation via Ras and Rap1 // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P.8069–8083.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал