Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 494, № 1, стр. 496-499

Шаперонная система – один из основных защитных механизмов клетки от стрессирующих факторов. С возрастом у людей снижается активность и эффективность шаперонного аппарата. Этот процесс традиционно коррелирует с повышением вероятности развития нейродегенеративных заболеваний, ассоциированных с протеотоксическим стрессом [1]. К подобным патологиям следует отнести болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амиотрофический боковой склероз, амилоидозы, обширную группу полиглутаминовых заболеваний и многие другие.

Одним из ключевых элементов шаперонной системы является белок теплового шока Hsp70 (heat shock protein 70 kDa, HSPA1A). Hsp70 препятствует развитию апоптоза, участвует в протеасомной деградации белков с некорректной конформацией [2], способен связывать мутантные неправильно свернутые белки и препятствовать их и агрегации при нейродегенеративных процессах [3].

В связи с этим исследователи возлагают большие надежды на применение химических индукторов белков теплового шока в качестве терапевтических агентов при лечении нейродегенеративных патологий. Соединения, способные вызывать накопление белка Hsp70 в клетках, продемонстрировали свою эффективность на моделях болезни Паркинсона [4], болезни Альцгеймера [5] и многих других. К сожалению, ни одно из известных соединений, индуцирующих синтез Hsp70, до сих пор не применяется в клинике. Одна из причин – побочные эффекты, в частности активация каспазы-3 в мотонейронах [6]. Поэтому поиск новых безопасных индукторов синтеза белков теплового шока остается актуальной проблемой современной нейробиологии.

Целью настоящей работы был поиск и верификация новых индукторов синтеза белка теплового шока Hsp70 среди доступной нам коллекции производных индолил- и пирролилазинов (в общей сложности более 50 соединений).

Для поиска индукторов синтеза Hsp70 была использована репортерная система, основанная на клеточной линии HeLa-hsp70.1pr-luc, трансфицированной геном люциферазы под контролем промотора, содержащего участок heat shock element (HSE), который в норме регулирует экспрессию генов нескольких белков теплового шока, в частности, Hsp70. Активация промотора происходит в ответ на тримеризацию белка Hsf1 [7] и приводит к накоплению люциферазы в модельных клетках.

Клетки карциномы шейки матки HeLa были получены из Российской коллекции клеточных культур (ИНЦ РАН, Санкт-Петербург). Клетки культивировали в среде DMEM (Gibco, США), содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки (Gibco, США), антибиотики пенициллин 100 ед./мл и стрептомицин 0.1 мг/мл (БиолоТ, Россия) при 37°С и 5% CO₂. Трансфекцию клеток осуществляли с помощью агента Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific, США) согласно рекомендациям производителя. Для выведения клеток HeLa-hsp70.1pr-luc в устойчивую линию использовали селективный антибиотик G418 (Gibco, США).

Анализ активности люциферазы в клетках HeLa-hsp70.1pr-luc был проведен с помощью набора BrightGlo (Promega, Великобритания) по протоколу, рекомендованному производителем. Для проверки потенциальных индукторов синтеза Hsp70 к клеткам HeLa-hsp70.1pr-luc добавляли химические соединения в концентрации 1 мкМ и спустя 24 ч анализировали активность люциферазы. Соединения, продемонстрировавшие способность активировать HSE, были затем проверены в том же тесте повторно, но с использованием нескольких концентраций (рис. 1). Анализ результатов и их статистическую обработку здесь и далее осуществляли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8. Было продемонстрировано, что производные пиррола PQ-29 и индола IQ-113 в концентрации 0.1 мкМ увеличивали активность люциферазы в 11.68 и 14.12 раза соответственно (по отношению к активности люциферазы в необработанных клетках). Увеличение концентраций PQ-29 и IQ-113 до 5 мкМ приводило к увеличению активности люциферазы до 17.47- и 27.82-кратного превосходства над необработанными клетками соответственно. Эти результаты показывают, что обнаружены соединения, вызывающие активацию HSE и синтез белков, транскрипция генов которых находится под контролем HSE-содержащего промотора.

Рис. 1.

Инкубация клеток HeLa-hsp70.1pr-luc с соединениями PQ-29 и IQ-113 приводит к повышению активности люциферазы. Различия с контролем достоверны (*) при р < 0.05 (критерий Манна–Уитни).

Далее была проверена способность отобранных соединений вызывать накопление белка Hsp70 в культуре клеток нейробластомы человека SH-SY5Y (получены из Российской коллекции клеточных культур, условия культивирования были такими же, как для клеток HeLa).

За 24 ч до эксперимента клетки рассевали в 6-луночную плату. Спустя сутки в ростовую среду добавляли PQ-29 либо IQ-113 в концентрациях 0.1, 0.5, либо 1 мкМ. В качестве положительного контроля индукции синтеза Hsp70 был использован тепловой шок при 43°С в течение 30 мин. Спустя еще 24 ч клетки лизировали, лизат подвергали электрофоретическому разделению и вестерн-блот анализу по описанному ранее протоколу [8]. Мембрану с перенесенными белками последовательно инкубировали с мышиными антителами против Hsp70 клон 3C5 [9], GAPDH (клон 6С5, Abcam, Великобритания) и затем с антителами против антител мыши, меченными пероксидазой хрена (Abcam, Великобритания). Окраску блота антителами против GAPDH использовали в качестве контроля общей белковой нагрузки проб. Результат гибридизации блота с антителами приведен на рис. 2а. На основе трех независимых экспериментов с помощью программного обеспечения TotaLab Quant был произведен денситометричейкий анализ интенсивности окраски полученных полос. Результат оцифровки представлен на рис. 2б как нормированное отношение интенсивности зон Hsp70 к интенсивности референтного белка GAPDH. Мы продемонстрировали, что PQ-29 и IQ-113 в концентрации 1 мкМ вызывают увеличение количества белка Hsp70 в клетках нейробластомы человека в 2.38 и 2.63 раза соответственно. Важно отметить, что тепловой шок (43°С, 30 мин) приводил к повышению уровня Hsp70 в 2.35 раза, что сопоставимо с влиянием PQ-29 и IQ-113.

Рис. 2.

Соединения PQ-29 и IQ-113 вызывают накопление белка Hsp70 в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y. (а) Результаты вестерн-блот анализа лизатов клеток SH-SY5Y, инкубированных с веществами в указанных концентрациях в течение 24 ч. (б) Результат оцифровки интенсивности зон блота, представленный как отношение интенсивности зон Hsp70 к интенсивности референтного белка GAPDH, нормированное на значение, полученное для необработанных клеток. Различия с контролем достоверны (*) при р < 0.05 (критерий Манна–Уитни).

Для изучения цитотоксических свойств PQ-29 и IQ-113 использовали тест определения активности внутриклеточных дегидрогеназ по Мосману (МТТ-тест) согласно описанному ранее протоколу [10]. Вычисление концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) проводили на основании результатов следующего эксперимента. Клетки SH-SY5Y культивировали в присутствии различных концентраций PQ-29 либо IQ-113. Диапазон использованных концентраций составлял от 0.1 до 409.6 мкМ с двукратным шагом. Спустя 24 ч клетки анализировали с помощью МТТ-теста. Для каждой экспериментальной точки было сделано по три повторности. Было установлено, что IC50 для соединения PQ-29 составляет 15.93 мкМ, а для IQ-113 – 32.04 мкМ (рис. 3).

Рис. 3.

Определение параметра IC50 для соединений PQ-29 и IQ-113 при воздействии на культуру клеток нейробластомы человека SH-SY5Y.

Таким образом, новые индукторы синтеза Hsp70, особенно, TM-113 видятся гораздо более безопасными в сравнении с аналогами. В качестве примера можно привести найденное нами ранее вещество U-133 (производное эхинохрома), для которого параметр IC50 составлял немногим более 5 мкМ [11], что в 3 раза ниже, чем IC50 для PQ-29 и в 6 раз ниже в сравнении с IQ-113. Тем не менее, очевидно, что изучение возможных побочных эффектов найденных индукторов Hsp70 на клеточную физиологию должно стать предметом будущих исследований.

С помощью репортерной системы, основанной на клетках HeLa-hsp70.1pr-luc, были обнаружены производные индолил- и пирролилазинов, которые вызывают накопление белка теплового шока Hsp70 в клетках. Была продемонстрирована безопасность соединений на культуре клеток нейробластомы человека при использовании их в концентрациях, вызывающих синтез Hsp70.