Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 495, № 1, стр. 632-637

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы половозрелые самцы сирийских хомячков (Mesocricetus auratus), полученные в ЦКП SPF-вивария ИЦиГ СО РАН. Животных  содержали индивидуально в клетках 36  × 23 × 12 см при световом режиме 12 ч : 12 ч (свет : темнота), 23–24°С и достаточном количестве корма и питья. Все процедуры проведены согласно директивам European Communities Council от 24 ноября 1986 г. (86/609/EEC) и заключению Биоэтической комиссии ФИЦ ИЦиГ СО РАН (протокол № 39 от 27 сентября 2017 г.).

Животных поделили на 2 группы, одна в течение 2.5 мес. пила воду, вторая – воду с ДОК (3 × 10¹⁰ частиц/г массы тела/сутки), размер наночастиц был 5 нм. Затем животных каждой группы вновь разделили на две подгруппы. Каждому животному одной из подгрупп внутрижелудочно были введены 100 метацеркарий O. felineus, предварительно выделенные из инфицированных язей, выловленных из реки Обь вблизи г. Новосибирска. Через 3 мес. после заражения сравнивали животных 4-х групп: 1) контрольные (КОН) – неинфицированные, пьющие воду (n = 5); 2) O. felineus-инфицированные (OF), пьющие воду (n = 5); 3) ДОК – неинфицированные, пьющие воду с наночастицами ДОК (n = 4); 4) OF + ДОК – O. felineus-инфицированные и пьющие воду с наночастицами ДОК (n = 4).

За месяц до окончания экспериментов исследовали относительный уровень нейрометаболитов в мозге хомячков с использованием оборудования ЦКП “Центр генетических ресурсов лабораторных животных” ФИЦ ИЦиГ СО РАН, поддержанного Минобрнауки России (Уникальный идентификатор проекта RFMEFI62119X0023) горизонтального томографа (Biospec 117/16 USR, Bruker, Германия) с индукцией магнитного поля 11.7 Тесла. Определяли уровни метаболитов в префронтальной области коры головного мозга, отвечающего за сложные формы поведения, и в гиппокампе, лимбической структуре, отвечающей за эмоции и память. МРТ исследование было проведено по стандартной ранее описанной методике [9]. Размер спектроскопических вокселей составлял 1.6 × 3.5 × 3.5 мм (рис. 1а, б). Все протонные спектры (рис. 1в) получены с помощью пространственно-локализованной одновоксельной спектроскопии (МРС) методом STEAM (stimulated echo acquisition mode spectroscopy) с параметрами импульсной последовательности TE = 3 мс, TR = 5 с и количеством накоплений 120. Для обработки экспериментальных спектров ¹H МРС и определения количественного состава метаболитов использовали описанные ранее программы [9, 10]. Уровни отдельных метаболитов представлены относительно суммы всех метаболитов.

Рис. 1.

Расположение вокселя для ¹Н МРС коры головного мозга (а) и гиппокампа (б). Типичный ¹Н МРС спектр (в). mIno – мио-инозитол; PCr – фосфокреатин; Cr – креатин; Glu – глутаминовая кислота; Gln – глутамин; Tau – таурин; Asp – аспартат; NAA – N-ацетиласпартат; GABA – гамма-аминомасляная кислота; MM – макромолекулы; Lac – лактат.

В конце эксперимента животных умерщвляли декапитацией, регистрировали массу тела, печени, селезенки и тимуса, а также подсчитывали число гельминтов у инфицированных хомячков.

Результаты статистически обработаны с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (“Statistica-6.0”): первый фактор “вещество” (вода или вода с ДОК), второй фактор “инфекция” (инфицированные и неинфицированные). Данные представлены как среднее ± SEM. Различия между животными считались статистически значимыми при p < 0.05 и на уровне тенденции при 0.05 < p < 0.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что ни длительное потребление воды с ДОК, ни введение метацеркарий O. felineus не влияют на прирост массы тела и относительную массу тимуса у экспериментальных животных (рис. 2a, б). В то же время, относительные массы печени и селезенки у всех инфицированных хомячков были увеличены, в обоих случаях влияние фактора “инфекция” было существенным (рис. 2в, г). Эти показатели не менялись на фоне постоянного потреблением ДОК. Длительное потребление воды с ДОК не препятствовало успешному внедрению и приживаемости гельминтов в печени животных, поскольку количество паразитов в печени у хомячков из групп OF и OF + ДОК было одинаковым (31.4 ± 2.6 и 33.5 ± 7.5 соответственно). Эти данные позволяют предположить, что наночастицы ДОК не оказывают периферический эффект.

Рис. 2.

Масса тела (а) и относительная масса тимуса (б), печени (в) и селезенки (г) у хомячков экспериментальных групп. *** p < 0.01 – по сравнению с КОН.

При отсутствии периферических эффектов, употребление воды с наночастицами ДОК в течение 2.5 мес. и далее при 3-х месячном инфицировании животных оказало влияние на мозг (рис. 3). В коре мозга животных OF было обнаружено повышение мио-инозитола (рис. 3а), маркера астроглии, и снижение глицина (рис. 3б), тормозного нейромедиатора, а длительное потребление хомячками воды с ДОК нормализовало эти показатели. Рост и интенсивность первого сигнала может указывать на реактивную пролиферацию астроцитов, которая происходит на фоне инфекций и нейродегенеративных заболеваний [11]. Снижение уровня второго может свидетельствовать о преобладании процессов возбуждения в мозге инфицированных животных. Установленное взаимодействие двух факторов воздействия в отношении глицина свидетельствует о корректирующем протекторном влиянии ДОК в отношении этого показателя.

Рис. 3.

Уровни мио-инозитола, глицина, лактата, холинсодержащих соединений в коре головного мозга, а также соотношение возбуждающих аминокислот к тормозным в коре и гиппокампе у хомячков экспериментальных групп. *p < 0.05; *** p < 0.001 – по сравнению с КОН; ^оp < 0.05; ^оop < 0.01; ^ооop < 0.001; ^(о) 0.05 < p < 0.1 – по сравнению с OF; ^дp < 0.05 – по сравнению с ДОК.

О преобладании процессов возбуждения над торможением в коре мозга инфицированных хомячков говорит и соотношение суммарно возбуждающих аминокислот (глутамат + глутамин + + аспартат) к тормозным (ГАМК + глицин) (рис. 3в). При этом длительное потребление воды с наночастицами ДОК снижает негативное влияние инфекции. Причем обнаружено статистически значимое взаимодействие двух факторов, свидетельствующее о защитном действии ДОК при нарушениях в коре мозга, обусловленных инфекционным агентом. В отличие от коры, в гиппокампе мозга, уровни возбуждающих и тормозных нейромедиаторов не менялись и это соотношение было приблизительно одинаковым у всех четырех групп сравниваемых животных (рис. 3г).

Уровень лактата, маркера гипоксии, не меняется в коре головного мозга животных всех групп, однако наблюдается тенденция к его снижению у инфицированных животных с длительным потреблением ДОК по сравнению с такими же хомячками, но пьющими воду (рис. 3д). Вероятно, хронический описторхоз, также как и печеночный шистосомоз, сопровождается изменениями энергетического обмена в коре головного мозга лабораторных животных [12], а длительное потребление ДОК способствует нормализации этого процесса.

Известно, что сигнал Cho на спектрограмме представляет собой сумму сигналов холинсодержащих соединений – фосфохолина, глицерофосфохолина и холина, причем основной вклад в этот сигнал в мозге вносит глицерофосфохолин [13]. Уровень этого сигнала был приблизительно одинаковым в коре головного мозга животных из групп OF и ДОК, однако сочетание двух факторов привело к значительному усилению сигнала (рис. 3е). Причина этого остается в настоящее время неясной. Как предполагают другие исследователи, это может быть связано с активацией астроцитоза, поскольку обнаруживают повышенные концентрации холина не в нейронах, а в глиальных клетках [14]. Исходя из того, что ДОК вносит существенный вклад в проявление этого признака у животных OF + ДОК, можно предположить, что предварительное потребление воды с наночастицами ДОК способствует повышению чувствительности астроцитов к последующему возможному действию неблагоприятных факторов. Например, показано, что при поражениях печени повышается уровень NH₃ в крови настолько, что он может проходить через гематоэнцефлический барьер, усиливая поступление в мозг молекул, оказывающих токсическое действие на астроциты [15]. Установленные в нашем исследовании повышенные сигналы мио-инозитола в коре головного мозга хомячков из группы OF также подтверждают то, что мишенью при O. felineus инфекции становятся астроциты. Учитывая все это, можно предположить, что повышение сигналов холинсодержащих соединений у OF + ДОК животных является результатом протекторного действия ДОК, направленного на пролиферацию астроцитов в мозге – основных глиальных клеток мозга, контролирующих метаболические процессы в нейронах.

Таким образом, проведенное исследование показало, что длительное превентивное потребление наночастиц аморфного диоксида кремния размером 5 нм не оказывает негативного влияния на физиологический статус здоровых хомячков и не нарушает биохимические процессы в мозге, оцениваемые по метаболическим показателям с помощью МРС-анализа. В то же время в коре головного мозга инфицированных животных эти наночастицы нормализуют соотношение возбуждающих и тормозных нейромедиаторов и препятствует изменению уровней мио-инозитола и лактата в мозге.