Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 495, № 1, стр. 643-647

Паразитические нематоды р. Meloidogyne (галловые нематоды) – опасные паразиты корневой системы, поражающие практически все виды высших растений, ущерб от которых исчисляется миллионами долларов [1]. Эффективные способы борьбы с этими паразитами отсутствуют. В последнее время успешно развивается экологически безопасное направление в защите растений, основанное на индукции их устойчивости [2]. Индуцированную устойчивость (ИУ) вызывают факторы биотической и абиотической природы, способные активизировать сложную интегрированную систему защитных механизмов и тем самым максимально реализовать естественный иммунный потенциал растений. Научный и практический интерес с этой точки зрения представляет изучение роли эссенциальных (жизненно необходимых) микроэлементов в реализации ИУ. Одним из таких элементов является кремний. Многочисленные исследования показали его значение в жизнедеятельности растений и регуляции абиотических и биотических стрессов, вызванных различными фитопатогенами, в том числе паразитическими нематодами [3]. Показано, что защитная роль кремния при биогенных стрессах связана с укреплением стенки эпидермальных клеток, обеспечивающих механический барьер. Присутствие кремния затрудняет атаку патогенов и вредителей, а также индуцирует биохимические защитные реакции растений [4]. О действии наноразмерного кремния (нанокремния) на растения в стрессовых условиях известно еще очень немного. Показано положительное влияние нанокремния при действии ряда абиогенных факторов (обезвоживание, соленость, тяжелые металлы) [5]. Изучения роли нанокремния как индуктора устойчивости растений в условиях биогенного стресса, вызванного фитопатогенами, до настоящего времени не проводилось. Антистрессовая активность кремния побудила нас к исследованию способности его наноразмерной формы выступать в качестве абиогенного индуктора устойчивости растений к паразитическим нематодам.

Исследования проводили на модельной системе: томаты Lycopersicon esculentum – галловая нематода Meloidogyne incognita (Kofoid et White, 1919) Chitwood, 1949. В работе были использованы томаты гибрида Гамаюн (ИУ 30%).

Для работы был использован препарат водного коллоидного раствора нанокремния, полученного методом лазерной абляции [6]. В качестве мишени был применен монокристаллический кремний. Средний размер частиц составлял 65.3 ± 1.6 нм, рН раствора 4.92, дзета-потенциал равен – 12.3 мВ, исходная концентрация – 10 мкг/мл. Работу проводили с двумя концентрациями препарата – 0.5 и 1.0 мкг/мл, эффективность действия которых на растения была показана ранее [6].

Поверхностно стерилизованные семена томатов замачивали в 2 мл препарата коллоидного раствора нанокремния течение 2 ч перед высадкой в грунт. Через 3 недели после прорастания семян часть растений инфецировали нематодой (3000 личинок на растение) и опрыскивали растворами нанокремния в тех же концентрациях, которыми обрабатывали семена (10 мл/растение). Контрольные семена и растения обрабатывали водой. Опыты проводили в 6-кратной повторности. Растительные пробы для анализов отбирали на 14-е сутки после инвазии и обработки растений препаратом кремния. Морфофизиологические параметры растений и нематод анализировали через 40 дней после инвазии. Устойчивость растений оценивали по степени поражения корней, количеству галлов/г корня и морфофизиологическим параметрам нематод (число половозрелых самок, их размеры).

Растения, пораженные галловыми нематодами, проявляют симптомы минерального голодания (хлороз листьев) и недостатка воды [7]. Поэтому, для оценки действия наноразмерного кремния на растения при инвазии паразитическими нематодами в настоящей работе были исследованы такие показатели как содержание фотосинтетических пигментов в листьях (важный и чувствительный показатель фотосинтеза, отражающими физиологическое состояния растений при действии стресса) и содержание ряда биогенных минеральных элементов в листьях и корнях растений томатов.

Содержание хлорофиллов и каротиноидов оценивали по спектрам поглощения этанольных экстрактов из листьев опытных растений [8].

Для определения элементного состава образцов применяли метод рентгено-флуоресцентного анализа (РФА). Качественный анализ образцов проводился на приборе M4 TORNADO, количественный – S2 PicoFox (оба прибора производства Bruker, Германия). Корни, стебли и листья здоровых и инвазированных нематодой томатов анализировали по стандартной методике ISO/TS 18705:2015 [9].

Статистический анализ был выполнен с использованием программного обеспечения “STATISTICA 12.0” (StatSoft Inc., USA). Для определения статистической значимости различия использовался t-критерий Стьюдента. Статистически значимыми считались различия при р < 0.05.

Результаты исследований показали, что обработка растений водными растворами нанокремния оказала влияние на устойчивость растений. При анализе морфофизиологического состояния нематод, а также зараженности растений и их состояния в период проведения эксперимента было выявлено стимулирующее влияние нанокремния на развитие и рост растений и ингибирующее на поражаемость растений и развитие паразита (табл. 1). Длина и вес стебля растений при обработке водными растворами нанокремния в концентрациях 0.5 и 1.0 мкг/мл, превосходили контрольные, что являлось показателем положительного действия препарата на инфицированные растения. Зараженность растений по сравнению с контролем в этих случаях была снижена на 28 и 32% соответственно. Меньший размер галлов и самок, а также отсутствие яиц в их отеках свидетельствует о задержке развития нематод в корнях обработанных растений.

Фотосинтетический аппарат в первую очередь подвергается воздействию стрессовых факторов. Особый интерес представляет изменение содержания фотосинтетических пигментов – хлорофилла а (Chl a), хлорофилла b (Cl b) и каротиноидов (Car). Результаты проведенных исследований показали, что содержание фотосинтетических пигментов в инвазированных растениях было ниже, в сравнении со здоровыми – Chl a на 10%, Cl b на 18%, Car на 20% (табл. 2).

Обработка приводила к незначительному превышению общего количества хлорофиллов в листьях, но содержание каротиноидов при концентрации 1.0 мг/мл снизилось на 44%. Обработка зараженных растений нанокремнием в концентрации 0.5 мкг/мл приводила к увеличению содержания фотосинтетических пигментов (хлорофиллов и каротиноидов) даже по сравнению со здоровыми растениями, что свидетельствовало о нормализации физиологического состояния растений, нарушенного инвазией нематодами. Концентрация 1.0 мкг/мл оказалась менее эффективной – количество хлорофиллов и каротиноидов в листьях хотя и было выше, чем в листьях необработанных инвазированных растений, однако было ниже, чем при обработке растений препаратом в концентрации 0.5 мкг/мл.

В регуляции процессов фотосинтеза и продуктивности растений большое значение имеют элементы минерального питания. Проведенные исследования показали, что экзогенная обработка растений нанокремнием существенно отразилась на содержании исследованных биогенных элементов (табл. 3). Так, на 14-й день после обработки в листьях неинвазированных (здоровых) растений существенно повысилось содержание Mg, Cl, P, Fe, а также P и K в корнях растений. В то же время содержание Ca и S в листьях и Cl в корнях заметно снизилось по сравнению с контрольными растениями. Инвазия растений нематодами значительное снизила содержание в листьях биогенных элементов, играющих важную роль в фотосинтезе и обменных процессах растений: P, Mg, K, S, Fe и Zn [10]. Повышение концентрации S, K и Са в корнях растений при инвазии, возможно, объясняется их оттоком из листьев и связано с жизнедеятельностью корнеобитающих нематод. При обработке нанокремнием в листьях инвазированных растений содержание P, Mg, K, S и Fe значительно возрастало по сравнению с необработанными и даже было больше, чем в здоровых растениях (табл. 3). В корнях, местах локализации паразита, содержание P и K было больше, чем в здоровых растениях, тогда, как содержание Ca, Mg, Fe практически не отличалось от содержания в здоровых корнях. Содержание S, Cl и Zn было ниже, чем в здоровых растениях, что, возможно, связано с особенностями метаболизма растений, обработанных нанокремнием. Томаты классифицируют как растения, не накапливающие кремний [11].

Проведенные нами исследования не выявили присутствия кремния в листьях, стеблях и корнях необработанных растений. При внекорневой обработке препаратом нанокремния он был обнаружен во всех органах растений, при этом распределение этого элемента по органам в инвазированных и здоровых растениях происходило по-разному (табл. 4). В здоровых растениях наибольшее количество кремния было обнаружено в листьях, а в инвазированных – в корнях. Изменение концентрации минеральных элементов в корнях обработанных препаратом растений, возможно, связано с присутствием в них кремния, поскольку известно, что он оказывает существенное влияние на поглощение и использование растениями других элементов минерального питания [12]. Аккумуляция кремния в корнях томатов, в местах их паразитирования и, соответственно, физического и секреторного воздействия на организм хозяина, вероятно указывает на участие этого элемента в индукции защитных реакций растений. Содержание кремния в данном случае более чем в 3 раза превышало содержание его в корнях здоровых растений. Ранее, на растениях риса, инвазированных галловой нематодой Meloidogyne graminicola, было показано, что уровень проявления защитных реакций, опосредованных кремнием, связан с увеличением его содержания в корнях растений [13].

Таким образом, проведенные исследования показали, что обработка растений томатов нанокремнием стимулирует ростовые процессы, снижает зараженность корневой системы нематодами и оказывает ингибирующее влияние на морфофизиологические показатели нематод. Отмеченное при этом возрастание содержания фотосинтетических пигментов и ряда биогенных элементов в инвазированных растениях, свидетельствует об улучшении их физиологического состояния. Этот факт, а также аккумуляция кремния в зоне паразитирования, позволяют рассматривать водный раствор коллоидного нанокремния в качестве абиогенного индуктора, активизирующего системы стрессорного ответа на инвазию, ограничивающие развитие паразита. Детали механизма этого индуцирования еще предстоит выяснить. В настоящее время показано, что кремний стимулирует устойчивость растений к бактериям, грибам, вирусам, насекомым и нематодам. Опосредованные кремнием механизмы устойчивости включают в себя синтез низкомолекулярных соединений, обладающих биоцидными свойствами (фитоалексины, фенолы), генерацию активных форм кислорода, активацию сигнальной системы растений (салициловой и жасминовой кислот, а также этилена) и индукцию защитных белков [14]. Свойства наночастиц кремния позволяют им непосредственно проникать в клетки растений и взаимодействовать с белками и другими биомолекулами. Такое прямое действие нанокремния может способствовать быстрой передаче клеточных сигналов и позволяет ему проявить большую биологическую эффективность в отношении фитопатогенов по сравнению с полноразмерным Si [15]. В настоящее время активно исследуются возможности применения нанокремния в сельском хозяйстве для производства удобрений, пестицидов и гербицидов, создании генетически модифицированных растений и ряда других технологий, направленных на решение сельскохозяйственных проблем, связанных с повышением продуктивности растений [5].

Полученные нами данные, позволяют рассматривать водный раствор коллоидного нанокремния в качестве индуктора устойчивости растений к биогенному стрессу, вызванному паразитическими нематодами. Возможно, это не единственная функция исследованного препарата, и спектр его применения может быть расширен.