Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2020, T. 495, № 1, стр. 648-652

Механизм катализируемых N-ацетилтрансферазами реакций переноса ацетильной группы от молекулы ацетилкофермента А (ацетил-КоА) на глутаминовую или аспарагиновую кислоту, приводящих к N-ацетилглутамату или N-ацетиласпартату, не установлен для многих ферментов и является предметом дискуссий. По результатам рентгеноструктурных исследований комплексов ферментов с аналогами субстратов обсуждаются два возможных сценария в активных центрах ацетилтрансфераз – многостадийный механизм по схеме “пинг-понг”, согласно которому на первом этапе ацилируется цистеин белка, а затем ацетильная группа переносится на субстрат [1], и механизм прямого переноса ацильной группы от ацетил-КoA непосредственно на субстрат. Трудности в определении механизма реакции связаны с тем, что не известны экспериментальные структуры комплексов фермента с кофактором и субстратом.

В настоящей работе мы используем современные методы компьютерного моделирования для построения трехмерной полноатомной модели комплекса белка с ацетил-КоА и глутаматом и для оценок энергий интермедиатов химических превращений в активном центре N-ацетилглутаматсинтазы из Neisseria gonorrhoeae (ngNAGS). Особенностью нашего подхода является то, что молекулярная модель механизма реакции конструируется на основе первичной последовательности аминокислотных остатков белка [2], а не на основе подходящей кристаллографической структуры. Сравнение результатов компьютерного моделирования с экспериментальными данными проводится для структуры комплекса фермента с продуктами реакции [3] на завершающей стадии исследования. Такой подход, хотя и требует больших усилий, но при успешной реализации достаточно убедителен в отношении надежности предсказаний теории.

На первом этапе мы применили биоинформатические программы для построения трехмерной структуры ngNAGS. Мы использовали процедуру HMMER [4] для сборки порядка 10 000 гомо-логичных  последовательностей из баз данных UniProtKB [2] и программу ClustalO [5] для уточнения множественного выравнивания. Для последующего предсказания коэволюционных контактов   аминокислотных остатков была использована программа ResPre [6], реализующая ковариационной анализ в рамках нейросетевой модели. Предсказание вторичной структуры белка проводилось с помощью программы PSSPred (zhanglab.ccmb.med.umich.edu/PSSpred/). Для быстрой генерации структур по предсказанным контактам при интеграции информации о вторичной структуре использовался сервер CONFOLD [7]. Сопоставление лучшей из предсказанных моделей с кристаллической структурой PDB ID 3B8G [3] комплекса ngNAGS с продуктами реакции показало, что среднеквадратичное отклонение по Cα атомам составляет 3.3 Å.

Попарные выравнивания для построения шаблонов были выполнены с помощью процедуры mapalign [8]. Кофактор и субстрат были интегрированы в шаблоны с помощью программы RosettaDock. При уточнении моделей по протоколу сравнительного моделирования RosettaCM [9] из списка шаблонов были исключены все известные структуры ngNAGS и их гомологи. Также гомологи данной последовательности были исключены в процессе генерации структурных фрагментов 3-пептидов и 9-пептидов. Были отобраны пять лучших по значению энергетической функции моделей, и после визуального анализа выбрана оптимальная структура для дальнейшего уточнения методами классической молекулярной динамики (МД).

МД траектории длиной 100 нс рассчитывались с помощью программы NAMD [10] в NPT ансамбле при температуре 300 К. Были использованы параметры силового поля CHARMM [11]. При расчетах на Cα атомы белка были наложены ограничивающие гармонические потенциалы, что является стандартной практикой при уточнении моделей после протокола RosettaCM [12]. Расчеты методом квантовой механики/молекулярной механики КМ(PBE0-D3/6-31G*)/ММ(AMBER) проводились с помощью программы NWChem [13]. Квантовая часть включала реакционный глутамат, фрагмент молекулы ацетил-КоА, молекулу воды, боковые цепи аминокислотных остатков Glu353, Ser392, Arg316, а также основную цепь Cys356 и Leu357.

Оптимизация геометрических параметров модельной системы методом КМ/ММ позволила впервые получить структуру комплекса N-ацетилглутаматсинтазы со встроенными молекулами ацетил-КоА и глутамата в активном центре фермента. Рисунок 1 иллюстрирует расположение основных участников реакции. Молекула глутамата (glutamate), фрагмент молекулы ацетил-КоА (acetyl-CoA), аминокислотный остаток Glu353 и молекула воды Wat показаны в шаростержневом представлении. Пара аминокислотных остатков Cys356, Leu357, важная для стабилизации тетраэдрического реакционного интермедиата, представлена линиями за исключением атомов азота, показанных шарами.

Рис. 1.

Фрагмент структуры фермент-субстратного комплекса N-ацетилглутаматсинтазы, предсказанной методами компьютерного моделирования. Расстояния между тяжелыми атомами приведены в Å. В цветном варианте атомы углерода показаны зеленым, кислорода – красным, азота – синим, серы – желтым, водорода – светло-серым.

В работе [3] была высказана гипотеза о механизме реакции синтеза N-ацетилглутамата ферментом ngNAGS – реакция проходит непосредственно между глютаматом и ацетил-КоА, а не в рамках “пинг-понг” механизма, когда ацетильная группа сначала переносится на один из остатков белка. Полученная нами модель подтверждает и уточняет эту гипотезу – в качестве обобщенного основания участвует консервативный остаток Glu353. Действительно, один из трех протонов аминогруппы глутамата может перейти на изначально депротонированную карбоксильную группу Glu353 по ориентированной цепи водородных связей с участием молекулы воды Wat – соответствующие расстояния N_G–O_W–O_ε (2.6 Å, рис. 1) благоприятствуют подобному переносу. Расчеты методом КМ/ММ показывают, что энергия интермедиата, полученного при переносе протона на Glu353, выше энергии фермент-субстратного комплекса примерно на 1 ккал/моль. Короткое расстояние (2.6 Å) между атомом азота N_G глутамата и атомом углерода С_S карбонильной группы ацетил-КоА также благоприятствует прямой нуклеофильной атаке с образованием те-траэдрического  интермедиата реакции. Аминокислотные остатки Cys356, Leu357 стабилизируют структуру интермедиата – соответствующие расстояния между атомами азота N_Cys и N_Leu и атомом кислорода О_S карбонильной группы ацетил-КоА, на котором возникает отрицательный заряд, составляют 2.9 и 2.8 Å (рис. 1). Расчеты методом КМ/ММ показывают, что энергия тетраэдрического интермедиата выше энергии фермент-субстратного комплекса на 17 ккал/моль, что допустимо для данной реакции. Разрыв связи С_S–S координированный с переносом протона на атом серы ацетил-КoА завершает реакцию. По результатам расчетов методом КМ/ММ энергия продуктов на 14 ккал/моль ниже энергии реагентов. Схема реакции представлена на рис. 2.

Рис. 2.

Механизм реакции синтеза N-ацетилглутамата в активном центре ngNAGS.

Структура конечной модельной системы с продуктами реакции, полученная методами компьютерного моделирования, может быть напрямую сопоставлена с экспериментальной кристаллографической структурой PDB ID 3B8G [3]. На рис. 3 показано наложение обеих структур. Среднеквадратичное отклонение по координатам Сα атомов для 144 наложенных аминокислотных остатков составляет 1.12 Å, что является очень хорошим показателем для результатов моделирования по гомологии. Положения боковых цепей важнейших аминокислот в активном сайте, кофермента и N-ацетилглутамата также находятся в хорошем согласии с экспериментальными конформациями. Модельная система воспроизводит ряд важных контактов в активном сайте белка, в частности карбоксильных групп N-ацетилглутамата с боковыми цепями Arg316, Arg425, а также карбонильной группы с основными цепями Cys356 и Leu357. Положение каталитического остатка Glu353 полностью соответствует конфигурации, наблюдаемой в кристаллографической структуре PDB ID 3B8G.

Рис. 3.

Наложение кристаллической структуры PDB ID 3B8G и структуры, полученной методами компьютерного моделирования. В цветном варианте: зеленый цвет – кристалл, красный – модель.

Таким образом, компьютерное моделирование позволило впервые построить комплекс N-ацетилглутаматсинтазы со встроенными молекулами ацетил-КоА и глутамата, проверить одну из гипотез о механизме реакции синтеза N-ацетилглутамата и подтвердить надежность моделирования при сопоставлении полученной модели комплекса фермента с продуктами и экспериментальной структурой белка.

Следует отметить, что задача исследования реакции синтеза родственного соединения N-ацетиласпартата, важной для изучения превращений этого метаболита в мозге человека [14], может быть решена сходными приемами. В отличие от N-ацетилглутаматсинтазы структура N-ацетиласпартатсинтазы плохо описана экспериментально, и при изучении синтеза N-ацетиласпартата остается надеяться на средства молекулярного моделирования.