Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 497, № 1, стр. 169-174

Мастит крупного рогатого скота (КРС) – экономически значимое заболевание, уменьшающее продуктивность животных и качество молока [1]. Основные данные о микробном составе молока были получены методами классической микробиологии. Однако известна проблема оценки микробного состава, связанная с трудно-культивируемыми формами. На современном этапе широко используются омиксные технологии, позволяющие исследовать полный состав флоры и сделать предположения о связи объекта и запускаемого им процесса [2]. В настоящем исследовании проведен сравнительный анализ микробных композиций здоровых животных и животных с субклинической и клинической формами мастита.

Отбор проб молока проводился асептически на фермах Центрального региона РФ (Московская и Тульская область) в летний период 2018 г. от коров черно-пестрой голштинизированной породы из каждой доли вымени отдельно, через 60–70 дней после отела. Выборка коров сформирована на основании количества соматических клеток (SCC, клеток/мл) в молоке, которое оценивалось с помощью лазерной проточной цитометрии (Somacount-150, “Bentley Instruments”, США). Для настоящего исследования был отобран 31 образец, выделены группы: 1 – клинически здоровые животные (З), 10 образцов, SCC менее 1.00 × 10⁵; 2 – субклинический мастит (С), 10 образцов, SCC 1.00 × 10⁵–5.00 × 10⁵ – клинический мастит (К), 11 образцов, SCC выше 1.00 × 10⁶.

Общая микробная ДНК выделялась из образцов с помощью набора Milk Bacterial DNA Isolation Kit (“Norgen Biotek”, Канада) в соответствии с инструкциями производителя. Вариабельные области V3–V4 гена 16S рРНК амплифицировались с использованием набора универсальных праймеров. Библиотеку готовили по протоколу 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina, США) и секвенировали (MiSeq 2 × 250) [3].

Аннотирование нуклеотидных последовательностей проводили с помощью ресурса MG-RAST [4]. Для аннотирования была использована база данных GreenGenes (https://greengenes.secondgenome.com). Окончательный сравнительный анализ изменения количества ОТЕ (оперативных таксономических единиц) в структурах микробиомов был проведен при помощи программного пакета DESeq2 R [5]. (табл. 1–3).

Из полученных данных при сравнении групп З/К/С видно, что общего изменения по разнообразию микрофлоры не происходило. Во всех трех группах превалирует тип Proteоbacteria (63.8–87.2%), далее следует тип Firmicutes (11.6–35.2%). Известно, что у коров голштино-фризской породы в здоровом вымени превалирует тип Firmicutes, с преобладанием рода Streptococcus [6]. Можно предположить, что в нашем случае происходит вытеснение типа Firmicutes протеобактериями. Так, при переходе от З к С значительно увеличивается содержание бактерий Pseudomonadales (26.8–42.9%) и Burkholderiales (24.3–37.2%). Среди представителей этих отрядов описаны возбудители мастита [7].

Уровень ОТЕ отряда Bacillales в трех группах примерно одинаковый. Однако при переходе от уровня отряда к семействам видно, что сем. Streptococcaceae, Staphylococcaceae и Bacillaceae возрастают у больных животных. Представители этих семейств описаны как основные возбудители воспалительных заболеваний КРС, в том числе мастита. Так, в качестве основных патогенов, ассоциированных с маститом, в литературе описаны Escherichia coli, Streptococcus, Staphylococcus [8], хотя внутри семейств наблюдаются различия в представителях [9].

В нашем случае высокая доля бактерий семейства Aerococcaceae сохранялась во всех трех категориях, доля Planococcaceae понижалась в образцах К/С. Ранее Aerococcaceae и Planococcaceae описаны как основные представители микрофлоры молока здоровых коров [10]. Planococcaceae также представлены в кишечнике КРС и составляют до 18% фекальной бактериальной популяции [11].

При рассмотрении семейства Staphylococcaceae во всех группах доминирует патоген S. sciuri. Кроме того, во всех образцах молока встречаются Macrococcus caseolyticus. По своим свойствам эти два вида, ранее относящиеся к роду Staphylococcus, близки, идентичность нуклеотидных последовательностей их генов 16S рРНК составляет >95.5% [12]. Поэтому мы рассматриваем S. sciuri и M. caseolyticus как группу S. sciuri.

Анализ присутствия Staphylococcaceae в пробах показал, что в отдельных образцах с увеличением SCC возрастает содержание S. haemolyticus. В то же время наибольшее количество S. haemolyticus находится в пробе c SCC=2.87 × 10⁶, тогда как в пробе со значением SCC=5.19 × 10⁶ присутствие S. haemolyticus незначительно. Содержание S. haemolyticus также различается в пробах молока, взятых из разных долей вымени у одного животного с примерно одинаковым значением SCC. Поэтому мы не можем однозначно утверждать, что увеличение SCC коррелирует с увеличением количества S. haemolyticus.

S. epidermidis обнаружен в большинстве исследованных образцов и в некоторых случаях содержится на высоком уровне. В отдельных образцах молока обнаружен S. aureus.

При сравнении количественных и качественных изменений микробиома для субклинической формы и клинического мастита не обнаруживается изменений среди наиболее распространенных ОТЕ (baseMean >1000.000) (дополнительные материалы статьи). Однако среди ОТЕ с меньшим распространением такие изменения есть. Заметно, что при переходе от образцов З к С/К уменьшается число Burkholderiales, в то время как увеличивается присутствие Actinomycetales.

Хотя представители этих отрядов описаны как представители нормальной микрофлоры молока, ряд видов Actinomycetales являются патогенами, ассоциированными с маститом [13].

Интересно, что во всех образцах обнаруживается в значительных количествах Pseudomonas viridiflava. Этот микроорганизм до сих пор обнаруживался исключительно на растениях [14], и ранее не был замечен в молоке коров. Возможно, P. viridiflava могут попадать в молоко извне через протоки молочной железы.