Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 497, № 1, стр. 165-168

В условиях лимфопении в организме возникают популяции суррогатных CD8+ Т-клеток памяти, по фенотипу похожих на истинные клетки памяти (“memory-like” CD8⁺, T_ML) [1–4]. Данные первоначальных экспериментов позволяли предполагать, что формирующаяся в условиях лимфопении популяция T_ML повторяет фенотипические особенности истинных клеток памяти и может заменить их в иммунном ответе [5, 6]. Однако накапливаются доказательства того, что T_ML схожи с истинными клетками памяти по профилю экспрессии поверхностных маркеров; вместе с тем имеются ключевые отличия. Так, экспрессия рецепторов хемокинов в T_ML отличается от таковой в истинных клетках памяти [7]. Описаны популяции T_ML с иммуносупрессорной активностью [8]. Более того, при лимфопении клоны Т-клеток с рецепторами высокоаффинного взаимодействия с собственными молекулами MHC (по существу, аутореактивные Т-клетки) пролиферируют и экспрессируют поверхностные маркеры клеток памяти [9, 10]. В настоящей работе исследован фенотип популяции CD8+ лимфоцитов, образующейся при адоптивном переносе сингенных спленоцитов мышам-реципиентам с лимфопенией после сублетального облучения.

Использованы мыши линий C57BL/6 (K^bI-A^bD^b) и C57BL/6-TgN(ACTbEGFP)1Osb (K^bI-A^bD^b) (далее B6.GFP, https://www.jax.org/ strain/003291) (разведение вивария НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина). В организме мышей линии B6.GFP GFP экспрессируется конститутивно под контролем куриного промотора бета-актина и цитомегаловирусного энхансера. Не зафиксировано отличий в функционировании иммунной системы трансгенных животных по сравнению с диким типом, что позволило использовать данную линию в экспериментах. Экспериментальные протоколы одобрены этической комиссией Института биологии гена РАН. Самок мышей C57BL/6 сублетально облучали (4.5 Гр однократно) на аппарате “Агат-Р” ((Россия), источник γ-излучения Co⁶⁰ с начальной мощностью 1.9  × 10¹⁴ Бк). Животных выводили из эксперимента на 10-й день после облучения, извлекали селезенки и гомогенизировали в фосфатно-солевом буфере при 4°C. Спленоциты осаждали центрифугированием (200 g, 5 мин). Эритроциты обрабатывали лизирующим буфером (BD Pharmingen, США). Мононуклеары трижды промывали фосфатно-солевым буфером и использовали для окрашивания моноклональными антителами и адоптивного переноса.

Использовали моноклональные антитела, конъюгированные с соответствующими флуоресцентными метками: PerCP-Cy5.5 – анти-CD8α (клон 53–6.7, BD Bioscience, США), APC-Cy7 – анти-CD62L (клон MEL-14, eBioscience, США), APC – анти-CD44 (клон IM7, eBioscience), PE-Cy7 – анти-CD3 (клон 145-2C11, eBioscience), PE – анти-CD122 (клон TM-β1, BD Bioscience), BV421 – анти-CD5 (клон 53-7.3, BD Biosciences), BV421 – анти-CXCR3 (клон CXCR3-173, BD Biosciences), PE – анти-CD49d (R1-2, BD Biosciences).

Адоптивный перенос осуществляли следующим образом: неиммунизированных мышей C57BL/6 облучали в дозе 4.5 Гр. Через 24 ч после облучения мышам внутривенно (в/в) вводили 1.5 × 10⁷ спленоцитов неиммунизированных сингенных животных или фосфатно-солевой буфер (контроль). Через 10 дней спленоциты мышей-реципиентов использовали для цитофлуориметрического анализа. Спленоциты (3 × 10⁶) инкубировали с блокирующими антителами Fc block (клон 2.4G2, BD Pharmingen, США; 10 мин 4°C), окрашивали флуоресцентно мечеными антителам (40 мин, 4°C) и анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Canto II (BD Bioscience) в программе FACSDiva 6.0 (BD Bioscience). Для характеристики популяций периферических Т-клеток анализировали не менее 10⁶ событий в каждом образце. Обработку данных проводили в программе Flow Jo 7.6 (TreeStar Inc., США). Результаты представлены как средняя величина ± ± стандартная ошибка (M ± SEM). Статистический анализ проводили с использованием непарного критерия Стьюдента. Различия признавали значимыми при p ≤ 0.05.

Обнаружено значительное увеличение относительного количества CD3+ лимфоцитов в селезенке мышей-реципиентов (рис. 1а). Кроме того, доля CD8+ Т-клеток также значительно возрастала у мышей-реципиентов по сравнению с неиммунизированным контролем и сублетально облученными животными (рис. 1а). Это означает, что при адоптивном переносе сингенных спленоцитов пролиферируют в основном CD8+ Т-клетки. Это согласуется с результатами исследований, показавших, что CD8⁺ клетки нуждаются в меньшем наборе стимулов для гомеостатической пролиферации по сравнению с CD4+ Т-лимфоцитами [11]. Практически все CD8+ Т-лимфоциты как донора, так и реципиента приобрели фенотип CD44+, как и ожидали в условиях лимфопении (рис. 1б). При этом доля потенциально аутореактивных клеток CD8+CD44+CD5+ в популяции лимфоцитов донора была достоверно выше, чем среди лимфоцитов реципиента (рис. 1б). Также значительно возросла доля CD8+CD122+ Т-клеток среди Т-лимфоцитов донора по сравнению с аналогичными популяциями реципиента, неиммунизированных и сублетально облученных мышей (рис. 1б). Отмечено достоверное увеличение доли Т-клеток, экспрессирующих CD49d в популяции клеток донора по сравнению с Т-лимфоцитами реципиента (рис. 1в). Помимо этого, относительное количество Т-лимфоцитов донора, экспрессирующих хемокиновый рецептор CXCR3, было достоверно выше, чем доля таких лимфоцитов в популяции Т-клеток реципиента (рис. 1в).

Рис. 1.

Относительное количество популяций Т-лимфоцитов в селезенке сублетально облученных мышей-реципиентов после адоптивного переноса сингенных спленоцитов. а – Относительное количество CD3+ и CD3+CD8+ Т-клеток в селезенке сублетально облученных реципиентов. Представлены данные для контрольных групп (неиммунизированные, облученные), отдельно для клеток реципента (GFP-) и донора (GFP+). Здесь и на рис. 1а–1б: данные получены в трех независимых экспериментах, 4–6 животных в каждой группе. Для статистического анализа использовали t-критерий Стъюдента (*p ≤ 0.05, **p ≤ ≤ 0.01). б – Относительное количество CD8+CD44+, CD44+CD5+ и CD8+CD122+ Т-клеток в селезенке сублетально облученных реципиентов. в – Относительное количество CD8+CD44+CD49d+ и CD8+CD44+CXCR3+ Т-клеток в селезенке сублетально облученных реципиентов.

Таким образом, при адоптивном переносе сингенных спленоцитов в селезенке сублетально облученного реципиента формируется популяция донорских Т-клеток с уникальными фенотипическими характеристиками – одновременной экспрессией маркеров истинных клеток памяти и супрессоров CD8+. Мы полагаем, что поверхностный фенотип, приобретенный Т-лимфоцитами донора в условиях лимфопении, может быть связан с недостатком или избытком сигналов, получаемых Т-лимфоцитами при взаимодействии Т-клеточного рецептора с собственными МНС/пептидными комплексами. Нами показано, что конкуренция за взаимодействие с собственными комплексами MHC-пептид среди Т-лимфоцитов, несущих трансгенную β-цепь ТКР, в мышах линии 1D1b приводит к изменению поверхностного активационного фенотипа по сравнению с Т-клетками этих же животных, экспрессирующих эндогенную β-цепь ТКР [12]. В нашей экспериментальной системе наивные клетки донора могут получать преимущество в связи с высоким уровнем экспрессии молекулы CD5, особенно ввиду того, что значительная часть наивных клеток реципиента погибла в результате сублетального облучения. Кроме того, в формировании обнаруженной популяции большое значение могут иметь изменения в микроокружении Т-лимфоцитов донора, возникшие в результате адоптивного переноса спленоцитов в венозное русло реципиента. Однако вне зависимости от причин, вызвавших появление такого профиля экспрессии поверхностных маркеров, наиболее важным остается вопрос о функциональных характеристиках обнаруженной популяции: способны ли они осуществлять полноценный иммунный ответ или представляют собой популяцию супрессорных Т-клеток? В последнем варианте полученные результаты могут иметь практическое значение для практики переливания крови и пересадки костного мозга, поскольку подобные популяции могут формироваться у пациентов [13], поэтому изучение функциональных характеристик обнаруженной популяции чрезвычайно важно и станет предметом наших дальнейших исследований.