Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 497, № 1, стр. 199-203

Создание селективных лекарственных средств является актуальнейшей задачей современной онкофармакологии. Часто эффективные препараты вызывают угрожающие жизни осложнения, что существенно ограничивает их применение. Так, для одного из этих препаратов – доксорубицина (Dox), была выявлена значительная кардиотоксичность [1–3]. При использовании этого препарата отмечены случаи, когда у больных проявлялись симптомы тяжелой сердечной недостаточности, что могло приводить к смерти пациента [1].

Предполагается, что побочные эффекты таких цитостатиков, как Dox, могут быть снижены путем пептидной модификации их молекул. Известно, что быстро делящиеся опухолевые клетки экспрессируют большее количество пептидаз, в частности, пролиназу, чем нормальные. В нормальных клетках гидролиз амидной связи у пролинсодержащих пептидов маловероятен. Используя эту особенность, можно создавать низкотоксичные пептидные модификации цитостатиков, устойчивые в здоровых тканях и превращающиеся в активные токсичные формы непосредственно в клетках опухоли. Действительно, в работе [4] было показано, что пептиды, содержащие Dox, могут подвергаться в опухолевых клетках протеолизу по связи Pro-Dox. Для исследований в настоящей работе были использованы Z-Gly-Pro-Dox и Boc-Gly-Pro-Dox, синтезированные с использованием известного набора приемов [5, 6].

Цель работы – сравнительный анализ цитотоксичности Dox и его пептидных модификаций Z-Gly-Pro-Dox и Boc-Gly-Pro-Dox на водных простейших Tetrahymena pyriformis.

Инфузории Tetrahymena pyriformis широко применяются в фармакологии, медицине, ветеринарии и экологии на первом этапе оценки безопасности и/или эффективности различных соединений. Tetrahymena pyriformis имеют линейные размеры 50 × 30 мкм и являются удобными объектами для исследований ввиду простой постановки опытов, основой которых является подсчет клеток, а также низкой стоимости культивирования, короткого жизненного цикла, позволяющего за счет высокой скорости размножения проследить их реакцию на воздействие токсиканта в ряду поколений за короткое время (6–96 ч). При этом показано, что результаты, полученные на инфузориях, имеют высокий коэффициент корреляции с данными подобных же исследований на мышах, крысах, кроликах и других животных [7–9].

Особенно ценным для данной работы было то, что с помощью инфузорий возможна оценка цитотоксичности не только водорастворимых соединений, но и соединений, растворимых в воде с добавлением дополнительного растворителя. Пробы не растворимых в воде препаратов Z-Gly-Pro-Dox и Boc-Gly-Pro-Dox получены в виде водных эмульсий с добавлением диметилсульфоксида (ДМСО). Z-Gly-Pro-Dox и Boc-Gly-Pro-Dox растворяли в 3% водном растворе ДМСО. Предварительные эксперименты показали, что ДМСО в указанной концентрации не оказывал никакого влияния на жизнедеятельность инфузорий.

Инфузории Tetrahymena pyriformis из собственной коллекции штаммов ФГБНУ НЦПЗ культивировались при стабильной температуре 25°С на стерильной 4-х компонентной среде: 1% пептон, 0.5% глюкоза, 0.2% дрожжевой экстракт, 0.1% хлористый натрий. На четвертые сутки после пересева на свежую среду инфузории использовали в опытах. Оценивали общее количество подвижных клеток в пробах при действии различных концентраций исследуемых веществ: от 10 до 100 мкМ. Каждую пробу оценивали в 3 повторениях, результат усредняли. В работе использовали автоматический анализатор БиоЛаТ (ГОСТ 31674-2012). Прибор БиоЛаТ [10] представляет собой оптико-механическое устройство, позволяющее вводить изображения лунок (емкости диаметром 10 и 15 мм) в компьютер и обрабатывать с помощью специальной программы AutoCiliata. Особенностью алгоритма подсчета клеток является оценка только подвижных объектов, которая основана на свойствах инфузорий этого вида – непрерывно двигаться, т.е. если организм жив – он движется. Общий алгоритм биотестирования состоит в циклическом подсчете инфузорий во всех лунках с пробами. На основании произведенных подсчетов инфузорий по каждой пробе вычисляли относительные количества выживших тест-организмов и проводили сравнительный анализ  токсичности  Dox  и  его  модификаций Z-Gly-Pro-Dox и Boc-Gly-Pro-Dox.

На первом этапе проводили два вида тестирования:

– острый опыт (10–30–60 минут), определяли концентрации препаратов, при которых происходит гибель и/или снижение подвижности 50% клеток в опыте (EC50) по сравнению с контролем – дистиллированной водой (цитотоксический эффект).

– хронический опыт (24 ч), определяли концентрации препаратов, при которых происходит снижение прироста популяции на 50% по сравнению с контролем (IС50) – дистиллированной водой (цитостатический эффект).

В остром опыте было установлено, что все три препарата дозозависимо снижают подвижность инфузорий. Самой высокой цитотоксичностью обладал немодифицированный Dox (EC50 < 10 мкМ), наименьшей Z-Gly-Pro-Dox (50 < EC50 < 100 мкМ), Boc-Gly-Pro-Dox занимал промежуточное положение (25 < EC50 < 50 мкМ) (рис. 1).

Рис. 1.

Острый цитотоксический эффект доксорубицина и его модификаций (▲ – Dox; ■ – Z-Gly-Pro-Dox; ♦ – Boc-Gly-Pro-Dox; * – отличие от доксорубицина, p < 0.05; # – отличие от Z-Gly-Pro-Dox, p < 0.05): а – при использовании 12.5 мкМ вещества; б – 25 мкМ; в – 50 мкМ; г – 100 мкМ.

Интересно отметить, что клетки реагировали на введение Z-Gly-Pro-Dox и Boc-Gly-Pro-Dox резким снижением подвижности (точка 10 мин), которая затем частично восстанавливалась. Эффект был дозозависимым. Для немодифицированного Dox он не отмечался.

В суточном тесте ингибирование роста популяции клеток инфузорий, по сравнению с контролем (дистиллированной водой), наибольшим цитостатическим эффектом обладал Dox (IС50 < < 10 мкМ), соответствующий эффект Boc-Gly-Pro-Dox и Z-Gly-Pro-Dox оказался достоверно ниже (IС50 38 ± 4 и 50 ± 5 мкМ соответственно) (рис. 2).

Рис. 2.

Цитостатический эффект доксорубицина и его модификаций в зависимости от дозы вещества (* – отличие от доксорубицина, p < 0.05, # – отличие от Z-Gly-Pro-Dox, p < 0.05) (по оси ординат – коэффициент роста инфузорий; по оси абсцисс – доза исследуемого соединения, мкМ).

На втором этапе изучали отдаленные цитотоксические эффекты препаратов. На пятые сутки культивирования определяли способность препаратов (в концентрации 100 мкМ) препятствовать спонтанному бактериальному загрязнению проб. По данным сравнительной турбидиметрии, наименьшая степень зарастания была зафиксирована в присутствии нативного Dox (опт.ед._600nm 81.1). Boc-Gly-Pro-Dox также обладал бактериостатическим действием, но менее выраженным (опт.ед._600nm 93.8). Степень зарастания в присутствии Z-Gly-Pro-Dox была близка к показателям дистиллированной воды (опт.ед._600nm 105.2 и 111.2 соответственно).

На заключительном этапе изучили токсичность исследуемых веществ на мышах. Беспородным самцам (возраст 6 мес, вес 20–25 г) однократно вводили внутрибрюшинно Dox и его пептидные модификации. Затем в течение 14 дней фиксировали гибель животных (табл. 1). Дозу LD50 рассчитывали по методу Кернера. Тестирование на мышах подтвердило низкую токсичность Boc-Gly-Pro-Dox и Z-Gly-Pro-Dox. LD50 нативного Dox составило 16 ± 2 мкг/кг, а для обеих модификаций LD50 оказалось выше 50 мкг/кг.

В результате проведенного исследования впервые при использовании тест-системы, основанной на использовании инфузорий Tetrahymena pyriformis, показано, что пептидная модификация молекулы антрациклинового антибиотика Dox снижает ее цитотоксические и цитостатические свойства. При этом можно отметить заранее не предсказуемый дозозависимый эффект, наблюдаемый при добавлении пептидных производных Dox, который заключался на первом этапе в резком снижении подвижности клеток, которая затем частично восстанавливалась (для немодифицированного Dox он не отмечался). Это, по-видимому, может указывать на то, что со временем при взаимодействии производных Dox с клетками инфузорий Tetrahymena pyriformis за счет пептидной компоненты действие Dox-фрагмента может быть выведено из процессов, влияющих на подвижность клеток и тем самым частично восстановить их жизнедеятельность. Модификация Z-Gly-Pro-Dox обладает меньшим цитотоксическим и цитостатическим эффектом по сравнению с Boc-Gly-Pro-Dox. Но, так как эти различия не велики, а как показали исследования [11], синтезированный Boc-Gly-Pro-Dox легче проникает через искусственные мембраны и более устойчив к действию пролиназы из клеток флавобактерий (Sigma-Aldrich, США), чем Z-Gly-Pro-Dox, оба этих соединения являются перспективными кандидатами для дальнейших исследований на опухолевых клетках. На это же указывают и данные, полученные и при изучении токсичности исследуемых веществ на теплокровных животных.