Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 497, № 1, стр. 194-198

ВВЕДЕНИЕ

Различные физиологические стимулы и патологические нарушения индуцируют образование р53-позитивных нейронов, включая депривацию нейротрофического фактора, гиперактивацию глутаматных рецепторов, гипоксию и ишемию, а также окислительный и питательный стресс, возникающий в результате воздействия окружающей среды, амилоидного β-пептида и оксида азота [1]. р53 активируется внешними и внутренними сигналами стресса, которые и способствуют накоплению в ядрах р53 в активной форме. Ингибиторная активность р53 предотвращает пролиферацию клеток с поврежденной ДНК или с канцерогенным потенциалом. Кроме того, р53 участвует в таких клеточных процессах, как дифференцировка, репарация ДНК и ангиогенез, которые также являются жизненно важными для подавления опухоли [2]. Точные факторы, влияющие на экспрессию р53 с целью запуска апоптоза, изучены лишь частично и являются предметом дальнейшего интенсивного изучения [2].

Обоняние играет важнейшую роль в восприятии внешнего мира крысами. Через обонятельную луковицу нервные импульсы от обонятельных рецепторов идут также частично в гиппокамп, который отвечает за поведенческие акты, память, исследовательскую активность. Ингибирующее действие гиппокампа на паравентрикулярные ядра, которые выделяются в качестве основного интегратора сигналов стресса между таламусом и другими центрами головного мозга [3], сохраняется при помощи относительно ограниченной популяции нейронов в вентральном основании гиппокампа [4]. Поражения в этой области приводят к увеличению высвобождения кортикостерона после стресса [4], что согласуется с контекстно-специфической модуляцией реакций на стресс гиппокампом.

В доступной нам литературе данных о влиянии хирургического повреждения слизистой оболочки полости носа на морфологические изменения нейронов в гиппокампе найдено не было.

Цель исследования: определить роль стрессорного влияния моделирования септопластики на экспрессию белка p53 в гиппокампе у крыс в условиях сенсорной обонятельной депривации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальное исследование было проведено на 30 половозрелых крысах-самцах линии Wistar возрастом 12–18 мес. 10 крыс составили контрольную группу. Перед операцией в хвостовую вену вводили раствор золетила (10 мг/кг). При помощи зигзагообразной скарификации слизистой оболочки перегородки носа острым зондом в каудо-краниальном направлении проводили моделирование септопластики. В экспериментальной группе крыс забивали на 2-е, 6-е и 14-е сутки после операции по 10 особей. Фиксацию головного мозга проводили до трепанации черепа путем введения через сердце физиологического раствора, а затем 10% раствора формалина в течение 5–10 мин. После трепанации черепа головной мозг фиксировали 10% раствором формалина, после чего заключали в парафиновые блоки. Получали 4 среза головного мозга во фронтальной плоскости толщиной 4 мкм с каждой крысы и окрашивали препараты методами иммуногистохимии к белку р53. Все срезы докрашивали гематоксилином Майера. Изучали субполя гиппокампа СА1, СА2, СА3 и зубчатую извилину (DG) (рис. 1).

Рис. 1.

Расположение субполей гиппокампа крысы. Иммуногистохимическая реакция анти-p53. Докрашивание гематоксилином Майера. Ув. ×100.

В пирамидном слое субполей на каждом срезе подсчитывали абсолютное количество нейронов, у которых была положительная ядерная реакция с антителами, а также нейрональные ниши. Выделяли нейроны на начальной стадии экспрессии белка p53 (положительная реакция на белок p53 в цитоплазме нейрона, четкое ядро без признаков кариорексиса) и на стадии апоптоза (окрашивание ядра нейрона антителами на белок p53, признаки кариорексиса, узкая полоска гипохромной цитоплазмы). Вычислялись средние значения и стандартные ошибки средней для срезов каждого животного и для группы в соответствующем субполе. Для оценки достоверности различий между группами использовали критерий Манна–Уитни при уровне значимости p < 0.05.

Исследования на животных проводили согласно требованиям “Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных” (1984 г.) и “Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях” (1986 г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование септопластики привело к увеличению численности р53-позитивных нейронов во всех субполях гиппокампа у крыс, по сравнению с данными группы контроля (рис. 1). Так, в субполях СА1 и СА2 подобное увеличение наблюдалось на 2-й и 4-й день, а на 6-й день после операции –только в СА1 (рис. 2а, 2б). В субполе СА3 и DG количество р53+ нейронов на ранних стадиях экспрессии было больше, чем в норме на всех сроках, а нейронов с выраженными признаками апоптоза в CA3 – на 2-й и 6-й день, в DG –на 4-й и 6-й день после операции (рис. 2б, 2в).

Рис. 2.

Изменение количества p53-позитивных нейронов на различных стадиях апоптоза в различные сроки после моделирования септопластики у крыс в зонах гиппокампа СА1 (a), CA2 (б), CA3 (в) и DG (г). ^† –достоверное различие между сроками наблюдения (p < 0.01); * –достоверное различие между данными эксперимента и нормой (p<0.01); ^‡ –достоверное различие между данными эксперимента и нормой (p < 0.05).

Колебания количества р53+ нейронов в динамике в каждом слое были следующими. Пик р53-позитивных нейронов на ранних стадиях был отмечен на 4-й день в субполях СА1 и DG (p < 0.01). Уменьшение этих нейронов к 6-му дню наблюдалось в субполе СА2. В СА3 было зафиксировано их стабильно высокое количество на всех сроках наблюдения (p < 0.01). В субполях СА1 (рис. 2a) и DG на 4-й и 6-й дни (p < 0.01) отмечалось стойкое увеличение нейронов на поздних стадиях апоптоза. К 6-му дню рост количества этих нейронов был отмечен в субполях СА2 и СА3 (p < 0.01). Необходимо отметить, что на 6-й день количество нейронов на поздних стадиях апоптоза было выше, чем нейронов на ранних стадиях экспрессии p53, в субполях СА1 (p < 0.05) и СА2 (p < 0.01) (рис. 2a, 2b, рис. 3).

Рис. 3.

Экспрессия белка p53 в нейронах гиппокампа крысы после моделирования септопластики: нормальные нейроны (зеленые стрелки), нейроны с начальными проявлениями экспрессии белка p53 (оранжевые стрелки), нейроны на поздних стадиях апоптоза (синие стрелки). Окрашивание антителами к белку p53, докрашивание гематоксилином Майера. Ув. ×600.

Количество нейрональных ниш в зоне СА1 после операции было достоверно выше на 4-й (0.5 ± 0.2) и 6-й (0.6 ± 0.3) дни после операции, по сравнению с группой контроля (0.20 ± 0.07) (p < 0.01) и по сравнению со 2-м днем (0.20 ± 0.09) операции (p < 0.01). В зоне СА2 была отмечена такая же тенденция, однако наблюдался рост их количества и на 6-й день (5.6 ± 0.0) после моделирования септопластики (p < 0.05). В зоне СА3 увеличение нейрональных ниш наблюдалось лишь на 6-й день (p < 0.01), но оно было значительное –1.50 ± 0.88, по сравнению с нормой (0.20 ± 0.09) и более ранними постоперационными сроками. В DG была зафиксирована аналогичная картина, что и в зоне СА2: по сравнению с нормой (0.2 ± 0.1), число нейрональных ниш было достоверно выше на четвертый (0.5 ± 0.1) (p < 0.05) и шестой (1.0 ± 0.2) дни (p  < 0.01). Также была отмечена динамика роста нейрональных ниш: их количество возросло на 4-е сутки (p < 0.05) и на 6-е сутки (p < 0.01), в сравнении с предыдущими сроками анализа.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Повышенная экспрессия р53 индуцирует гибель нейрональных клеток даже в отсутствие травмы, ишемии или эксайтотоксичности [5]. На примере эмбрионов мышей было показано, что p53 может защищать нейроны от апоптоза при определенных условиях во время нейрогенеза [6], однако в нейронах взрослых особей р53, как правило, ассоциируют с остановкой клеточного цикла, апоптозом и репарацией ДНК [7]. р53 может также присутствовать в аксональных терминалях, вызывая синаптическую дегенерацию [8].

Экспрессия p53 может быть важной для апоптоза нейронов после ишемии или эксайтотоксичности. Это было доказано в исследованиях, показывающих, что количество p53 в нейронах увеличивается в ответ на эти воздействия [9]. Повышенная экспрессия гена р53 также наблюдалась после экспериментальной черепно-мозговой травмы [10]. Уже через 6 ч после травмы мРНК р53 индуцируется преимущественно в нейронах, уязвимых к черепно-мозговой травме, таких как контуженная кора, латеральные и медиальные геникулярные ядра таламуса, а также нейроны в СА3 и DG гиппокампа [11].

В настоящем исследовании показано, что количество p53-позитивных нейронов (рис. 3) и нейрональных ниш в гиппокампе увеличивается на фоне скарификации слизистой оболочки перегородки носа у крыс. Отчетливо видно, что в CA1 и СА2 на 6-й день увеличивается количество нейронов на поздних стадиях апоптоза. Подобные явления в гиппокампе можно объяснить постхирургическим отеком в первые дни, сужением носовых ходов и последующей гипоксией [12]. Многие исследования убедительно доказывают, что р53 участвует в апоптозе нейронов, который наблюдается после инсульта или черепно-мозговой травмы [9]. В предыдущих наших исследованиях было показано, что сенсорная депривация периферической части обонятельного анализатора при септопластике провоцирует выраженные морфофизиологические стрессовые реакции: изменение в балансе вегетативной нервной системы [12], тревожно-депрессивное состояние [13] и вызывает увеличение количества темных нейронов в гиппокампе [14] вследствие нарушения носового дыхания и острого состояния гипоксии у животных. Полученные экспериментальные данные служат убедительным доказательство того, что манипуляции в области перегородки носа приводят к выраженным нейрофизиологическим стрессорным реакциям [12–14]. Это важно для понимания острого постоперационного болевого синдрома, выбора адекватной стратегии его купирования у пациентов, перенесших септопластику, так как проблема профилактики острой боли в хирургической ринологии окончательно не решена [15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Стрессовое влияние моделирования септопластики у крыс, сопровождающегося сенсорной депривацией периферического отдела обонятельного анализатора, провоцирует экспрессию p53 и запуск механизмов апоптоза в различных субполях гиппокампа.