Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 498, № 1, стр. 254-257

В настоящее время дератизация стала одним из факторов отбора экстремального характера в эволюции синантропных грызунов, поскольку она представляет собой хорошо организованную систему мероприятий, проводимых в течение длительного срока в большей части населенных пунктов, прежде всего городах [1]. По мере усовершенствования методов контроля численности в популяциях грызунов возникают адаптации к мерам дератизации как ответ на непрерывное действие химических факторов истребления. К числу таких адаптаций можно отнести физиолого-генетическую устойчивость к родентицидам-антикоагулянтам, которые считаются эффективными и относительно безопасными с точки зрения сохранения биоразнообразия средствами контроля численности грызунов. Генетическая устойчивость к антикоагулянтам обусловлена возникающими и закрепленными естественным отбором мутациями гена VCORC1.

Впервые аминокислотные замены Leu128Ser и Tyr139Cys, отвечающие за резистентность к варфарину, были обнаружены в Англии [2, 3]. Ген резистентности VCORC1 расположен у серых крыс (Rattus norvegicus) в хромосоме 1 [4], а у Mus domesticus – в хромосоме 7, которая является аналогичной хромосоме 1 у крыс [2]. Изначально в ряде стран Европы у M. domesticus было обнаружено две мутации гена VCORC1 (Tyr139Cys, Leu128Ser), но благодаря относительно недавним исследованиям их список был значительно расширен [5, 6]. У серых крыс также выявлен ряд мутаций, обеспечивающих резистентность к антикоагулянтам первого и второго поколений (Leu128Ser, Leu120Gln, Ile82Ile, Il82Il, Trp59Gly, Tyr139Cys, Tyr139Ser, Tyr139Phe, Leu128Gln, Arg35Pro). Сведения о географическом распространении устойчивых к антикоагулянтам первого и второго поколения серых и черных крыс (Rattus rattus), M. domesticus можно найти в ряде работ [5, 7, 6, 8, 9 ]. В странах Западной Европы географическое распространение отдельных мутаций гена VCORC1 отличается [8]. Существуют наиболее часто встречающиеся мутации у крыс и мышей, такие как Tyr139Cys и Leu128Ser, но каждая страна или регион характеризуется, кроме того, уникальными мутациями, обеспечивающими резистентность к антикоагулянтам, встречающимися только там. В недавних исследованиях во Франции и Германии у домовых мышей обнаружено девять точечных мутаций гена VKORC1, выявлены носители одновременно двух мутаций, которые объясняются генетической рекомбинацией [5, 6]. До сих пор в России физиологическую резистентность к антикоагулянтам первого и второго поколения у синантропных грызунов оценивали только на основании устаревшего, дорогостоящего и инвазивного метода, основанного на поедании приманок, содержащих эти соединения, и определении летальной дозы. В нашей работе впервые для территории России проведена оценка генетической резистентности к антикоагулянтам у домовых мышей и серых крыс на основании анализа мутаций гена VCORC1.

Цели исследования: на основании анализа изменчивости гена VCORC1 у домовых мышей (M. musculus) и серых крыс (R. norvegicus) из популяций, населяющих РФ, выявить наличие (или отсутствие) и географическое распространение мутаций, определяющих резистентность этих видов к антикоагулянтам; оценить эволюционное значение найденных мутаций и замен в экзонах у домовых мышей и серых крыс.

Материалом для молекулярно-генетического анализа служили 125 домовых мышей (M. musculus) и 19 серых крыс (R. norvegicus) из 13 населенных пунктов (городов и сел) России. Домовые мыши отловлены в: гг. Москва – 16, Подольск – 4, Ногинск – 4, Ростов-на-Дону – 18, Астрахань – 3, Тюмень – 24, Ямбург – 3, Чита – 19, а также сельских населенных пунктах: селах Тормосин (Волгоградская область) – 16, Балабаны (Волгоградская область) – 3, Дьяковка (Саратовская область) – 1, Большевик (Забайкальский край) – 3, Нижний Цасучей (Забайкальский край) – 7. Серые крысы отловлены в: гг. Москва – 18 и Тюмень – 1. После отлова грызунов содержали в стандартных пластиковых клетках для лабораторных животных. Перед взятием тканей зверьков умерщвляли смещением шейных позвонков. ДНК серых крыс и домовых мышей выделяли из тканей разных частей тела (хвост, сердце, мышцы конечностей), которые хранили в 96% спирте при температуре 6°C. Для выделения ДНК использовали наборы DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). ПЦР проведена в термоциклере SimpliAmp™ (Applied Biosystems). Для амплификации геномной ДНК домовых мышей использовались следующие праймеры: экзон 1 – GACCAATCTTCCGGTAGGAG (прямой праймер), CGACCCCAGACTCCAAAAT (обратный праймер); экзон 3 – GAAGCACCTGCTGTCTGTCA (прямой праймер), GCCTTCTAGGAACCCACACA (обратный праймер).

Амплификация проводилась с помощью набора 2х Мастер-микс HotStarTaq Plus (Qiagen). В 25 мкл реакционной смеси входил микс из смеси полимераз (HS-Taq и Pfu), смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов, ПЦР-буфер, Mg²⁺ и другие реагенты (ДНК-матрица – 1–2 нг, деионизированная вода (Н₂О) до 50 мкл, прямой и обратный праймеры – 0.1–800 нМ). Режим ПЦР включал следующие условия: 94°C в течение 3 мин, 25 циклов амплификации (94°C – 30 с, 58°C – 30 с и 72°C – 1 мин 30 с и финальную достройку цепей (72°C – 10 мин). ПЦР для тотальной ДНК серых крыс проведена с использованием следующих праймеров: экзон 1 – RE1AF CTCTTGTGTCTGCGCTGTAC, RE1R GCTTTTCATTTCTGCACGCA; экзон 3 – RE3F TGAGTTCCCTGGTGTCTGTC, RE3R TTTTAGGGACCCACACACGA [8]. Условия ПЦР: 94°C – 3 мин, 35 циклов амплификации (94°C – 30 с, 58°C – 30 с и 72°C – 1 мин и финальную достройку цепей (72°C – 10 мин). Для очистки ПЦР-продуктов использовался набор QIAquick PCR Purification Kit. Cеквенирование ПЦР-продуктов проводилось по обеим цепям с помощью генетического анализатора 3500xL (Applied Biosystems). Было отсеквенировано 2 участка ДНК гена VCORC1 у домовых мышей (250 п.н. – 1-й экзон, 330 п.н. – 3-й экзон) и серых крыс (209 и 227 п.н. соответственно). Выравнивание последовательностей ДНК произведено с помощью  программы BioEdit v.7.0.5.3, анализ в MEGA V.10.05. Полученные нуклеотидные последовательности для обнаружения гомозиготных мутаций гена VCORC1 сравнивались с диким типом контрольных последовательностей из базы данных GenBank/NCBI: (NM_203335.2 для R. norvegicus и NM_178600.2 для M. musculus). Для обнаружения гетерозиготных мутаций сравнивали хроматограммы положения нуклеотидов в последовательностях прямого и обратного праймеров. Для оценки соотношения синонимичных и несинонимичных замен (dN/dS) в экзонах у домовых мышей и серых крыс использовали программу DNAsp, v.6.

У домовых мышей не обнаружено мутаций гена VCORC1, отвечающих за резистентность к антикоагулянтам первого и второго поколения по позициям Leu128Ser и Tyr139Cys, локализованных в третьем экзоне [10, 5, 8 ]. Однако в городах мы обнаружили две ранее не описанные мутации в первом экзоне Lys58Arg и Ser31Trp. В Ростове у 13.7% от всех исследованных мышей, в Москве – 87.5%, в Тюмени – 13%, в Ногинске и Подольске – 100%. Мутации были вызваны применением антикоагулянтов первого и второго поколения: в г. Москва, Московская область – бромадиалон, бродифакум в концентрации 0.005%; в г. Ростов-на-Дону – бромадиалон в концентрации 0.005%, тетрафенацин в концентрации 0.25%, а также варфарин и дифенацин, в г. Тюмень – бромадиолон, бродифакум – 0.005% и дифацинон – 0.0075%. Таким образом, концентрация приманок в городах России не превышала нормы. Дератизационные мероприятия в городах России проводились согласно постановлению правительства РФ от 22 сентября 2014 г. № 58 (“Санитарно-эпидемиологические требования к организации и проведению дератизационных мероприятий”). В Западной Европе (Германии, Швейцарии, Франции) концентрации веществ были сходными (варфарин – 0.025%, куматетралил – 0.05%, бромадиалон – 0.005%, дефинакум – 0.005%, бродифакум – 0.005%, флокумафен – 0.005% [5, 6]).

В Швейцарии, Германии [5] и Франции [6] находили мутации в первом экзоне, повышающие резистентность к антикоагулянтам, причем Arg12Trp, Ala26Ser, Ala48Thr, Glu37Gly встречаются как во Франции, так и в Германии. В России в первом экзоне нами обнаружены две другие мутации Lys58Arg и Ser31Trp, которые могут быть либо нейтральными, либо повышать устойчивость к антикоагулянтам. Не исключено, что они могут быть уникальными для нашей страны. Аминокислотные замены (Lys58Arg и Ser31Trp) локализуются вместе у анализируемых образцов M. musculus, что, по-видимому, связано с эпистатическим эффектом.

Следует отметить, что процентное соотношение особей, несущих мутации резистентности и не имеющих эти мутации, существенно различается в разных странах и в разных районах одной и той же страны и может зависеть от интенсивности использования и набора применяемых антикоагулянтов. Так, в Европе частота встречаемости мышей-носителей мутаций гена VCORC1 чрезвычайно высока и может составлять до 70–80%. Например, в Германии, Швейцарии и на Азорских островах было обнаружено, что 80% мышей, отловленных в 30 локалитетах, являются носителями одной мутации. И лишь один локалитет оказался свободен от мышей-носителей мутаций Leu128Ser и Tyr139Cys [5]. Напротив, в Австралии и Аргентине эти мутации не были обнаружены [11, 12], а в Италии только у одной особи из 30 была найдена мутация Tyr139Cys [13]. В городах России мы не выявили ранее описанных мутаций, обеспечивающих резистентность у домовых мышей.

Из 19 проанализированных серых крыс г. Москвы только у трех особей в гетерозиготном состоянии была найдена одна из мутаций (Tyr139Ser) резистентности к антикоагулянтам (варфарину). Процент резистентных особей составил 15.7%. Крысы, у которых была обнаружена резистентность, отловлены в трех округах г. Москвы: Юго-Западном, Северном и Северо-Восточном. Основными действующими веществами в Москве во время проведения мероприятий по дезинфекции и дератизации служили антикоагулянты второго поколения – бродифакум и бромадиолон с концентрацией активного действующего вещества 0.005%. По данным немецких коллег [5] антикоагулянты второго поколения (бромадиолон и бродифакум) могут стимулировать развитие генетической резистентности у домовых мышей и серых крыс по мутации Tyr139Ser.

Оценка соотношения синонимичных и несинонимичных замен (dN/dS) у анализируемых синантропных грызунов показала следующее: у домовых мышей, в первом экзоне dN/dS > 2.74, в третьем экзоне dN/dS > 3.06; у серых крыс в третьем экзоне dN/dS > 3.0. Таким образом, более высокие значения несинонимичных замен свидетельствуют о действии положительного отбора в изученных популяциях M. musculus и R. norvegicus.

Подводя итоги, следует отметить, что относительно низкий процент мутаций гена резистентности VCORC1 у домовых мышей и серых крыс в населенных пунктах России может свидетельствовать об относительно редком и относительно недавнем начале использования антикоагулянтов по сравнению с большинством стран Западной Европы. Высокую частоту мутирования этого гена во Франции исследователи объясняют частым и постоянным применением антикоагулянтов населением, после которого значительная часть грызунов, получивших полулетальную дозу, выживает [6]. Именно в результате этого дератизация превращается в фактор отбора, приводящий к быстрому мутированию гена резистентности VCORC1, сохранению и закреплению в популяциях мышей все новых и новых мутаций, обеспечивающих резистентность.