Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 499, № 1, стр. 354-359

Переход к репродуктивной фазе является важнейшим этапом в онтогенезе цветковых растений. У растения длинного дня (ДД) Arabidopsis thaliana (L.) Heynh ключевыми фитогормонами, контролирующими индукцию цветения, являются гиббереллины (ГК) [1], которые строго необходимы и в условиях короткого дня (КД) [2]. На ДД гиббереллины вовлекаются в индукцию цветения опосредованно через регуляцию экспрессии и функционирования основных флоральных интеграторов фотопериодического пути цветения FLOWERING LOCUS T (FT) и SOC1. Накопление ГК в листьях приводит к деградации транскрипционных репрессоров группы DELLA и индуцирует транскрипцию гена FT [3, 4] за счет активации транскрипционных факторов CO и SPL [5]. В апикальной меристеме ГК-зависимая деградация DELLA-белков приводит к активации экспрессии LEAFY и SOC1, что, в свою очередь, обеспечивает переход к цветению [6].

Помимо гиббереллинов, важная роль в зацветании принадлежит абсцизовой кислоте (АБК). В зависимости от условий произрастания и физиологического состояния растения воздействие АБК способно как ускорять, так и задерживать переход от вегетативной стадии онтогенеза к репродуктивной [7]. В основе задержки цветения растений в условиях ДД лежит функционирование АБК-зависимых транскрипционных факторов ABI4 и ABI5 [8, 9]. ABI4 ингибирует переход к цветению, подавляя биосинтез ГК и стимулируя экспрессию флорального репрессора FLOWERING LOCUS C (FLC) [8–10]. Дополнительный вклад в активацию FLC вносят DELLA-белки, обеспечивая тем самым тесную взаимосвязь с ГК-зависимыми ответами [11].

Универсальный стрессовый белок GRUSP (Germination-Related Universal Stress Protein), кодируемый геном At3g58450 A. thaliana [12, 13], является потенциальным участником механизмов, контролирующих баланс между АБК и ГК на разных стадиях развития растения. Экспрессия At3g58450 значительно возрастает в проростках Col-0, обработанных АБК, а нарушение его транскрипции приводит к АБК–гиперчувствительности трансгенных семян grusp-115 [12].

Цель данного исследования заключается в том, чтобы впервые изучить взаимосвязь позднецветущего фенотипа трансгенной линии grusp-115, характеризующейся пониженной экспрессией гена At3g58450 из-за вставки Т-ДНК в его 3’-UTR область, с содержанием эндогенных гиббереллинов и экспрессией генов, контролирующих переход растения к репродуктивному развитию.

В исследовании использовали растения дикого типа A. thaliana (L.) Heynh экотипа Columbia (Col-0)   и   гомозиготной   трансгенной   линии GABI_kat 115C08 (grusp-115) [12]. Растения выращивали в почве в климатической камере с 16-часовым фотопериодом при интенсивности освещения 100 мкE м^–2 с^–1 и температуре +21°С.

Развитие растений Col-0 и grusp-115 анализировали в соответствии со шкалой стадий роста, которая используется для идентификации и интерпретации фенотипических различий и определения конкретных стадий роста у A. thaliana так, как описано ранее [14]. Индикатором наступления генеративной стадии является появление головки соцветия в розетке растения. Время цветения выражено в количестве дней после стратификации или количестве розеточных листьев на момент появления цветочной почки.

Содержание активных ГК определяли в 10 мг лиофилизированных образцов, полученных из розеточных листьев 4-недельных растений Col-0 и grusp-115 [15]. Из исследований, основанных на использовании изотопов, известно, что обработка экзогенными ГК приводит к эффективному поглощению ГК листьями и к их последующему транспорту в апексы побегов в биологически активной форме [16]. В связи с чем реакцию растений на экзогенные ГК изучали с использованием 100 мкМ водного раствора ГК4 + 7 (“Sigma”, США). Для этого проростки, начиная с возраста 14 дней, дважды в неделю в течение 12 нед опрыскивали раствором ГК в присутствии 0.02% (v/v) Твин-20. Контрольные растения опрыскивали раствором, содержавшим только 0.2% (v/v) Твин-20.

Уровни транскриптов генов FLC (At5g10140) и FT (At1g65480) оценивали методом ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR) так, как было описано ранее [13]. Для амплификации фрагментов генов использовали пары праймеров: FLC 5'–AAAGTAGCCGACAAGTCACC–3' и 5'-GGATGCGTCACAGAGAACAG–3'; FT 5'–GCCAGAACTTCAACACTCGC–3' и 5ʹ-AGCCACTCTCCCTCTGACAA–3'. Эксперименты проводили в 3-кратной биологической повторности. Достоверность различий проверяли при помощи критерия Стьюдента (t-критерий).

Установлено, что задержка прорастания трансгенных семян grusp-115 является результатом изменений в экспрессии генов метаболизма ГК, в том числе генов биосинтеза, GA20ox1 и GA3ox1 [13]. Снижение интенсивности экспрессии генов биосинтеза ГК также может быть причиной и более длительной стадии вегетативного роста, наблюдаемой у grusp-115 (рис. 1а).

Рис.1.

Характеристика растений Col-0 и grusp-115 в условиях роста на длинном дне: а – диаграмма развития растений согласно Бойес (Boyes) [14]. Цифрами обозначена группа растений, чей возраст соответствует (1) – 23, (2) – 34 и (3) – 42 дням роста после стратификации, и у которых были собраны образцы розеточных листьев для анализа содержания транскриптов генов FT и FLC методом qRT-PCR; б – внешний вид (1) – 23, (2) – 34 и (3) – 42- дневных растений.

У Col-0 через 28–30 дней после стратификации сформировалась хорошо видимая головка соцветия, в то время как у grusp-115 наблюдалась задержка формирования соцветия до 35 дней. Более того, удлинение стебля у Col-0 началось через 3–5 дней после появления цветочной почки, в то время как у grusp-115 этого не происходило, и головка соцветия дольше сохранялась внутри листьев  розетки (рис. 1б; номер 2 – растения 35-дневного возраста). Полноразмерные побеги с цветками и стручками сформировались у 45-дневных растений Col-0, в то время как grusp-115 в этом возрасте находился на стадии удлинения побега  и раскрытия первых цветочных почек (рис. 1б, номер 3–45-дневные растения). Таким образом, временная разница между Col-0 и grusp-115 составила 10 дней с момента образования соцветия и удлинения побега. Впоследствии grusp-115 сформировал полукарликовый побег со стручками, измененными по длине и форме, с небольшим количеством семян (рис. 1б). Полноценные побеги с развитыми стручками развились только через 50–55 дней.

На ДД как минимум два фактора могут играть ключевую роль при переходе растения от вегетативной стадии развития к генеративной: фотопериодизм и гиббереллины [4]. При этом фотопериодический путь играет основную роль в индукции цветения, а ГК выполняют вспомогательную функцию [4].

Наши результаты демонстрируют, что позднее зацветание grusp-115, вероятно, связано со сниженным содержанием биологически активных ГК1 и ГК3 (рис. 2) и может быть устранено обработкой растений экзогенными ГК (рис. 3). Важным параметром роста и развития A. thaliana является количество розеточных листьев [2, 14]. В условиях ДД Col-0 формирует 10–14 розеточных листьев, после чего апикальная меристема побега перестраивается в меристему соцветия [14]. В нашем исследовании растения Col-0 сформировали в среднем по 11 розеточных листьев за период вегетативного роста, в то время как grusp-115 переходили к цветению только при наличии 14 листьев (рис. 3а). Обработка растений экзогенными ГК ускоряла переход к репродуктивной стадии Col-0, который наблюдался при наличии у растений не 11, а лишь 9 листьев. Растения grusp-115 реагировали на обработку ГК сходным образом (рис. 3б). Они зацветали так же, как Col-0, после формирования 9 розеточных листьев (рис. 3а). Таким образом, отставание в переходе к цветению, выраженное в количестве розеточных листьев, полностью устранялось у grusp-115 при обработке экзогенными гиббереллинами. ГК-зависимое восстановление позднецветущего фенотипа grusp-115 до фенотипа Col-0 подтверждает идею о том, что трансгенная линия испытывает дефицит эндогенных ГК (рис. 2). В то же время обработка ГК grusp-115 не устраняла более поздний (на 10 дней) переход к цветению трансгенной линии по сравнению с Col-0 (рис. 3а).

Рис. 2.

Содержание биоактивных гиббереллинов ГК1 и ГК3 в тканях 4-недельных вегетативных розеток растений Col-0 и grusp-115. Звездочкой обозначены статистически достоверные различия между Col-0 и grusp-115 согласно критерию Стьюдента (* – p < 0.1).

Рис. 3.

Реакция растений Col-0 и grusp-115 на обработку 100 мкМ раствором экзогенных гиббереллинов ГК₄₊₇: а – время цветения растений, выраженное в количестве дней после стратификации и количестве розеточных листьев на момент появления цветочной почки в розетке; б – фенотип растений до и после обработки ГК через 42 дня роста. Звездочками обозначены статистически достоверные различия между Col-0 и grusp-115 согласно критерию Стьюдента (** – p < 0.05).

Для поиска других возможных причин временного отставания перехода к цветению линии grusp-115 от Col-0 был проанализирован уровень экспрессии ключевых флоральных генов FT и FLC в розетках двух сравниваемых линий на разных стадиях развития растений (рис. 4). Для этого использовали розеточные листья растений 23-, 34- и 42-дневного возраста, обозначенные под номерами 1, 2, и 3 соответственно. Ген FT экспрессировался на низком уровне в листьях любого возраста (рис. 4), но с максимальной интенсивностью в возрасте 42 дней (3), что соответствует цветущему растению со сформированными соцветиями (рис. 1б). Растения grusp-115 демонстрировали сниженный уровень экспрессии гена FT как на стадии вегетативного роста в возрасте 23 дней (1), так и на стадии перехода к цветению в возрасте 42 дней (рис. 4; (3)).

Рис. 4.

Относительный уровень экспрессии генов FT и FLC в розеточных листьях растений Col-0 и grusp-115. Образцы отбирали на разных стадиях роста растений, соответствующих их возрасту в 23 (1), 34 (2) и 42 (3) дня после стратификации. Звездочками обозначены статистически достоверные различия между Col-0 и grusp-115 согласно критерию Стьюдента (* – p < 0.1, ** – p < 0.05).

Репрессор цветения FLC, подавляющий экспрессию ряда флоральных генов, в том числе и FT, тормозит переход к генеративной стадии развития [6]. На рис. 4 видно, что уровень экспрессии гена FLC выше у grusp-115 на всех изученных стадиях роста (1–3; рис. 1а), чем у Col-0. Эта разница максимальна в возрасте 34 дней (2), когда растения Col-0 уже находятся на стадии формирования побегов соцветия, а grusp-115 все еще находятся в вегетативном состоянии. Более того, уровень транскриптов FLC повышен у grusp-115 даже после появления бутонов (3), что объясняет у него пониженную экспрессию гена FT.

Таким образом, мы впервые показали, что в основе более позднего перехода к цветению Т-ДНК инсерционной трансгенной линии grusp-115 A. thaliana по сравнению с диким типом является низкое содержание биологически активных эндогенных ГК1 и ГК3, а также слабая экспрессия гена FT из-за повышенного накопления флорального репрессора FLC. Мы предполагаем, что белок GRUSP является новым регуляторным компонентом в сигнальных путях, обеспечивающих переход к цветению.