Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 499, № 1, стр. 301-303

Разработка новых технологий культивирования клеток является одной из важных задач тканевой инженерии. Для сохранения нативной морфологии клеток и межклеточных взаимодействий применяется трехмерное культивирование клеток на различных конструкциях. В качестве таких конструкций применяются как трехмерные пористые скаффолды [1–3], так и микроносители различной формы [4–6]. Помимо подложки для культивирования клеток, микроносители являются эффективным средством для доставки клеток в область поврежденной ткани или органа, так как позволяют обеспечить благоприятные условия для клеток в ходе их доставки, что значительно повышает жизнеспособность клеток [7]. Технология инкапсуляции позволяет получить стабильные альгинатные микроносители в форме микросфер заданного диаметра, однако культивирование клеток на поверхности таких микроносителей неэффективно вследствие низкой шероховатости поверхности и отрицательного заряда альгината при физиологических условиях [6]. На данный момент охарактеризовано множество биосовместимых материалов, которые являются эффективными субстратами для культивирования клеток, таких как коллаген, эластин, хитозан и др., однако, получение микроносителей на их основе затруднено в связи с рядом природных особенностей полимеров – ограниченной растворимостью, сложностями при стабилизации и структурировании [8]. В данной работе предлагается оригинальная методика модификации поверхности альгинатных микроносителей путем ковалентной пришивки коллагена к поверхности микроносителей.

Нами разработан способ получения альгинатных микроносителей, покрытых коллагеном, выделенным из хвоста крыс породы Wistar, путем ковалентной пришивки коллагена к альгинату. Для получения альгинатных микроносителей диаметром 200–300 мкм был использован инкапсулятор модели B-390 (BUCHI Labortechnik AG, Швейцария) [6]. Активацию карбоксильных групп на поверхности альгинатных микроносителей производили путем последовательной обработки 3 мМ раствором 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида  и  10 мМ  раствором N-гидроксисукцинимида в течение 1 ч в каждом растворе [9]. Данные вещества не оказывают токсического эффекта на клетки, в отличие от глутарового альдегида или параформальдегида, которые также применяются в качестве перешивающих агентов, что позволяет сохранить биосовместимые свойства получаемых микроносителей. Активацию проводили при рН 6 в растворе, содержащем 5 мМ дигидрофосфата натрия и 100 мМ хлорида натрия. Далее микроносители осаждали путем центрифугирования в течение 15 мин при 1800 g и переносили в раствор аналогичного состава с рН 6. К суспензии микроносителей добавляли раствор коллагена с концентрацией 3 мг/мл, выделенного из хвостов крыс породы Wistar, в объемном соотношении микроносителей к раствору коллагена 1 : 3. Раствор коллагена получали по описанной ранее методике [10], такой раствор содержит около 60% коллагена I типа. Полученную смесь инкубировали при перемешивании в течение 12 ч при комнатной температуре. Далее полученные альгинатные микроносители, покрытые коллагеном, центрифугировали в течение 15 мин при 1800 g и переносили в раствор, содержащий 5 мМ дигидрофосфата натрия и 100 мМ хлорида натрия с рН 6. Полученные микроносители покрывали вторым слоем коллагена по аналогичному протоколу.

Для доказательства ковалентной пришивки коллагена к поверхности альгинатных альгинатных микроносителей сами микроносители были окрашены были окрашены красителем Кумасси R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250). Для окрашивания использовали 15-кратный раствор красителя в смеси этанола, дистиллированной воды и ледяной уксусной кислоты в объемном соотношении 4 : 4 : 1 с концентрацией 2.5 мг/мл. Перед окрашиванием микроносители отмывали от несвязавшегося белка путем двухкратного центрифугирования в течение 15 мин при 1800 g в дистиллированной воде. Затем микроносители переносили в однократный раствор красителя на 30 мин и отмывали аналогичным путем. Таким образом была доказана ковалентная пришивка коллагена к поверхности альгинатных микроносителей. На рис. 1б представлено изображение окрашенных микроносителей. Было выявлено равномерное окрашивание поверхности микроносителей. Также важно отметить, что произведенные манипуляции по модификации поверхности не приводят к разрушению микроносителей, их деформации и агрегации. Альгинатные микроносители были окрашены аналогичным способом, микроносители также сохранили характерные размеры и форму, однако окрашивания выявлено не было (рис. 1а).

Рис. 1.

Альгинатные микроносители (а) и альгинатные микроносители, поверхность которых покрыта коллагеном (б), после отмывки от красителя Кумасси R-250, световая микроскопия, изображение в проходящем свете, ×100, масштабный отрезок – 100 мкм.

Коллаген I типа является самым распространенным белком межклеточного матрикса и играет ключевую роль в поддержании его структурной и функциональной целостности, а также является важной функциональной биомолекулой. Молекула коллагена содержит последовательности аминокислот, которые обеспечивают специфическое связывание с рецепторами-интегринами на поверхности клеток. Такое взаимодействие приводит к активации внутриклеточных цитоплазматических сигнальных каскадов. Адгезия клеток, обусловленная взаимодействием с интегринами, играет ключевую роль во многих биологических процессах, таких как эмбриогенез, поддержание гомеостаза и формирование и регенерация тканей [11]. Таким образом, введение коллагена в состав конструкций для тканевой инженерии и регенеративной медицины может значительно увеличить жизнеспособность клеток на поверхности микроносителей. Кроме того, разработанный протокол модификации может быть адаптирован для получения альгинатных микроносителей с поверхностью, модифицированной различными белками и их комплексами, что позволит получить широкий спектр микроносителей с различными свойствами для культивирования и доставки клеток для тканевой инженерии и регенеративной медицины.