Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 500, № 1, стр. 451-454

Структура Sfmbt и получение специфичных поликлональных антител

Белок Sfmbt имеет две основные изоформы длиной 1220 a.о. (изоформа Sfmbt-PB) и 868 a.о. (изоформа Sfmbt-PA, рис. 1а). Обе изоформы содержат четыре MBT-повтора в середине белка (536–975 а.о. относительно изоформы B) и SAM-домен на C-конце (1140–1203 а.о. относительно изоформы B), однако изоформа Sfmbt-PA лишена N-концевого домена, имеющегося у Sfmbt-PB. Домен, содержащий четыре MBT-повтора, необходим для взаимодействия с ДНК-связывающими белками Pho и Phol, тогда как SAM-домен образует контакты с другим PcG-фактором – Scm [11].

Рис. 1.

(а) Структура белка Sfmbt у Drosophila melanogaster (показаны изоформы Sfmbt PB и PА). Cерые прямоугольники – MBT-повторы, темно-серый прямоугольник – SAM-домен. Обозначенная область 976-1139 а.о. была использована в качестве антигена. (б) Результаты Western-блот-гибридизации, полученные при анализе аликвот очищенного комплекса Sfmbt. Стрелками указаны полосы, соответствующие изоформам PB и PА. Output – ядерный экстракт после инкубации с антителами против Sfmbt, либо против неспецифических антител (IgG). IP – элюированные пробы, полученные после инкубации с антителами против Sfmbt, либо против неспецифических антител (IgG). М – маркер длин, полосы соответствуют размерам 100 и 130 кДа. (в) 20 наиболее представленных белковых партнеров Sfmbt, идентифицированных в протеомном анализе. Показано число пептидов (peptide count) в случае иммунопреципитации с антителами против Sfmbt (столбец Sfmbt IP) и в случае использования неспецифических иммуноглобулинов (столбец IgG IP).

Для получения поликлональных антител была создана конструкция для наработки антигена, соответствующего фрагменту С-конца белка Sfmbt (976–1139 а.о. изоформы B, рис. 1а). Данная область была выбрана в качестве антигена исходя из двух соображений. Во-первых, использованный участок присутствует в обеих изоформах Sfmbt. Таким образом, антитела, полученные к данной области, будут детектировать оба варианта белка Sfmbt. Во-вторых, участок между MBT-повторами и SAM-доменом уникален для Sfmbt и не содержит гомологий с другими белками. Полученная конструкция для наработки антигена была создана на основе вектора pET32a (Novagene) и содержала слитые в одну рамку считывания с фрагментом Sfmbt два шестикратных гистидиновых тага (6xHisTag, на N- и С-концах фрагмента Sfmbt), необходимые для последующей очистки антигена.

После наработки (в клетках E. coli BL21) и очистки (использована Ni Sepharose 6 Fast Flow, Sigma) антигена были проведены процедуры по иммунизации кроликов. Полученную сыворотку очищали с использованием исходного антигена, ковалентно пришитого к сефарозе CL-4B. Очищенные поликлональные антитела применяли для выделения белкового комплекса.

Очистка и анализ белкового комплекса Sfmbt

Для выявления белковых партнеров Sfmbt был применен метод иммунопреципитации из ядерного эмбрионального экстракта (возраст эмбрионов – 1–12 ч) с использованием полученных антител. Методы выделения ядерного экстракта и иммунопреципитации были подробно описаны ранее [12, 13].

На рис. 1б показаны результаты вестерн-блот анализа, проведенного с использованием аликвоты материала, который в дальнейшем был проанализирован методом пептидного секвенирования LC-MS. Для окрашивания были использованы те же антитела, что и для иммунопреципитации. В элюате, полученном с использованием специфичных антител, детектируются две полосы, соответствующие по молекулярным массам изоформам Sfmbt-PB и Sfmbt-PA (расчетные массы 134 и 96 кДa соответственно). При этом данные полосы отсутствуют в контрольном эксперименте, где в качестве неспецифичных антител были использованы IgG неиммунизированного животного. Вместе с тем анализ экстракта после инкубации с антителами (Output) показывает истощение Sfmbt в случае использования специфических антител в сравнении с контрольными IgG.

На следующем этапе выделенный материал анализировали методом масс-спектрометрии LC-MS, позволяющим идентифицировать все представленные в иммунопреципитате пептиды. Анализ проводился, как подробно описано ранее [13], для идентификации пептидов использованы базы данных UniProt Drosophila melanogaster и DTASelect. На рис. 1в показаны 20 идентифицированных белков, показавших наибольший уровень обогащения при проведении масс-спектрометрических исследований. Для белка Sfmbt было выявлено 59 пептидов против 0 пептидов в контрольном образце с неспецифическими антителами. Это подтверждает высокую специфичность проведенной очистки. Среди основных партнеров Sfmbt выделяются субъединицы комплексов ремоделеров хроматина семейства SWI/SNF. Детальный поиск субъединиц ремоделеров показал, что в иммунопреципитате присутствуют все компоненты комплексов BAP и PBAP (рис. 2а).

Рис. 2.

Sfmbt взаимодействует с ремоделерами хроматина и ДНК-связывающими факторами. Представлены результаты протеомного анализа для компонентов хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF (а), PcG-репрессоров (б) и белков с ДНК-связывающими мотивами типа “цинковые пальцы” С2Н2-типа (в). Остальные обозначения как на рис. 1.

На следующем этапе мы проверили, какие еще белки из группы Polycomb детектируются в интерактоме Sfmbt (рис. 2б).

Были найдены два белка, входящих в состав комплекса PRC2 (E(z) и Caf55), и один белок из комплекса PRC1 (Sce/dRING). Интересно, что ни белок Pho, ни белок Phol, не детектировались в выделенном комплексе. Полученные данные предполагают, что использованные нами антитела преципитируют Sfmbt в составе отличного от описанного ранее PhoRC комплекса. В данном комплексе также могут находиться компоненты с ДНК-связывающей активностью, необходимые для рекрутирования Sfmbt на хроматин. Предполагается, что основную роль в привлечении PcG-комплексов у дрозофилы играют белки с мотивами “цинковые пальцы” C2H2-типа [14]. Поэтому на следующем этапе мы провели поиск таких факторов в списке идентифицированных белков (рис. 2в). Самое большое число пептидов (84) соответствовало белку Hang (Hangover). Данный фактор содержит в своем составе 19 мотивов типа “цинковые пальцы” C2H2-типа. Кроме того, среди обнаруженных белков присутствовал фактор Combgap (Cg), для которого ранее были показаны связывание с PRE-элементами и взаимодействие с PcG-репрессорами [15].

Идентифицированные ДНК-связывающие белки потенциально могут принимать участие в привлечении Sfmbt в определенные локусы генома, однако конкретную роль выявленных факторов в процессах рекрутирования Sfmbt (как и, возможно, других PcG-репрессоров) предстоит установить в будущем.