Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 500, № 1, стр. 455-459

Оливомицин А (I; рис. 1) и другие антибиотики-производные ауреоловой кислоты активно исследовались и некоторое время применялись в качестве противоопухолевых агентов. Мишень этих соединений – малая бороздка ДНК [1, 2]. Образование стабильного комплекса I с мишенью приводит к ингибированию транскрипции и репликации; гибель опухолевых клеток достигается в наномолярных концентрациях [3]. Общерезорбтивная токсичность ограничивает клиническое использование столь активного природного соединения. Требуется исследование молекулярных механизмов действия I для создания его эффективных и менее токсичных аналогов.

Рис. 1.

Формулы оливомицина А (I) и его полусинтетического аналога оливамида (II).

Предпочтительные сайты связывания I содержат GC-квартеты; наибольшую константу связывания обеспечивают центральные динуклеотиды 5'-GG-3' или 5'-GC-3' [4]. Подобные последовательности часто встречаются в регуляторных областях генов и могут полностью или частично перекрываться участками узнавания транскрипционных факторов (ТФ), например, Sp1. Аффинность к ДНК и выраженная GC-специфичность объясняют способность I и других соединений этого класса ингибировать транскрипцию генов. Детальное изучение комплексов с ДНК позволило создать полусинтетический аналог I – оливамид (II; рис.1) с уменьшенной константой комплексообразования, терапевтической активностью и переносимостью в моделях in vivo [5].

Антибиотик I подавляет экспрессию c-Myc – онкогена [6, 7], экспрессированного во многих опухолях [8]. Существенная часть транскрибируемого участка гена c-Myc, а также его 5'-UTR область представлены CpG-богатыми участками и содержат GC-консенсусы, с которыми способны связываться I и II [9]. Промоторы P0-P3 гена c-Myc также содержат GC-богатые области. Правомерно предположить, что подавление транскрипции c-Myc может происходить из-за связывания I и II с регуляторными участками гена или с сайтами связывания ТФ. Взаимодействуют ли I и II только с определенными регуляторными областями, в частности, с консенсусными участками для GC-зависимых ТФ, или и с другими GC-участками?

В настоящей работе ингибирование c-Myc соединениями I и II исследовали на культивируемых опухолевых клетках человека: родительской линии НСТ116 (аденокарцинома кишки) и сублиниях HCT116TRE-CMV-Fl-cMyc и A375-TRE-CMV-Fl-cMyc (меланома) с соответствующими индуцибельными генетическими конструкциями.

Относительное содержание мРНК эндогенного c-Myc определяли на клетках НСТ116. После добавления I или II (100 нМ) клетки HCT116 инкубировали в течение 3–24 ч и оценивали уровень мРНК c-Myc с помощью количественной ПЦР после обратной транскрипции. Интенсивность сигналов рассчитывали относительно уровня мРНК гена RPLP0. Соединения I и II после 6 ч инкубации снижали количество мРНК c-Myc на ~25% по сравнению с интактными клетками (рис. 2); к 24 ч транскрипты c-Myc почти не определялись.

Рис. 2.

Уровень мРНК c-Myc в клетках HCT116 после инкубации с соединениями I и II (100 нМ) в течение 3–24 ч. Уровень мРНК c-Myc в необработанных клетках принят за 1. Представлены средние величины и стандартные отклонения по результатам трех экспериментов.

Известно, что производные ауреоловой кислоты ингибируют транскрипцию Sp1-зависимых генов [10]. Консенсусный участок связывания ТФ Sp1 (G/T)GGGCGG(G/A)(G/A)(C/T)) содержит GC-участки – вероятные сайты связывания I. Показано, что производные ауреоловой кислоты специфичны именно для Sр1-зависимых промоторов [10, 11]. Однако экспрессия самого Sp1 также ингибируется производными ауреоловой кислоты [11, 12]; 5'-нетранслируемый район и область старта транскрипции этого гена содержат большое число CpG-островков. Для решения вопроса о том, обязательно ли мишень I и II должна включать сайт взаимодействия указанного ТФ, получена сублиния клеток HCT116-TRE-CMV-Fl-cMyc с возможностью индукции экзогенного c-Myc доксициклином (Dox). Генетическая конструкция, использованная для получения сублинии, включала последовательность TRE-CMV, не имеющую GC-участков связывания Sp1 (рис. 3а, верхняя и средняя панели).

Рис. 3.

Ингибирование активации c-Myc под действием I и II.

а – Схема фрагмента плазмидной конструкции TRE-CMV-Fl-cMyc и экспрессии Fl-cMyc при добавлении I (100 нМ) и Dox (1 мкг/мл); б – иммуноблоттинг лизатов клеток HCT116-TRE-CMV-Fl-cMYC при добавлении I и доксициклина (Dox), стрелками обозначены эндогенная (○) и экзогенная (●) формы белка cMyc; в – иммуноблоттинг лизатов клеток A375-TRE-CMV-Fl-cMyc при действии Dox, I и II: в дорожках 4 и 7 вначале добавляли I/II, через 1 ч вносили Dox; в дорожках 5 и 8 – обратный порядок добавления модуляторов. Бета-актин использовали для нормализации – контроля внесения белков в полиакриламидный гель.

Принцип функционирования индуцибельной системы Tet-On: в отсутствие Dox элемент rtTA блокирует инициацию транскрипции (верхняя панель); Dox cвязывает элемент rtTA, активируя транскрипцию (средняя панель). Связывание I или II с GC-участками возможно только в CMV-промоторе (нижняя панель), поэтому действие антибиотиков на экспрессию репортерного гена c-Myc обусловлено их комплексообразованием только с этими участками.

Экспрессию рекомбинантного белка Fl-cMyc активировали добавлением Dox (рис. 3б). Соединение I (100 нМ, 24 ч) полностью подавляло экспрессию эндогенного c-Myc. В комбинации с Dox I ингибировал и эндогенный белок c-Myc, и экзогенную форму, активируемую Dox. Схожие эффекты наблюдали при добавлении I и II к клеткам сублинии A375-TRE-CMV-Fl-cMyc (конструкция Fl-cMyc под контролем Tet-On элемента и CMV-промотора; рис. 3в). Соединения I и II оказывали выраженный ингибирующий эффект на обе формы белка cMyc (рис. 3в, дорожки 3, 4 и 6, 7 по сравнению с контролями). Если клетки предварительно инкубировали 1 ч с Dox, подавление cMyc было менее выраженным (рис. 3в, дорожки 5 и 8). Сравнивая эффективность I и II для разных линий клеток, можно предположить, что степень ингибирования эндогенного и экзогенного cMyc может быть тканеспецифичной и определяться молекулярным окружением генов-мишеней и отдельных сайтов связывания I и II.

Полученные результаты подтверждают предположение о том, что для связывания с ДНК и ингибирования транскрипции производными ауреоловой кислоты наличие полноразмерного сайта связывания Sp1 не обязательно. Определяющим для формирования комплекса с ДНК и, следовательно, ингибирования транскрипции являются предпочтительные для I или II GC-участки. Таким образом, производные ауреоловой кислоты ингибируют транскрипцию не сайт-специфическим, а сиквенс-специфическим образом. Для I нуклеотидные последовательности в GC-квартетах, предпочтительные для формирования стабильных комплексов, установлены [4]; требуется выявить закономерности предпочтения для II. Важно, что активность II как ингибитора онкогена с-Мус почти не уступает I. Наряду со способностью вызывать гибель опухолевых клеток разного тканевого происхождения и приемлемыми характеристиками in vivo [5], оливамид II приобретает значение противоопухолевого лекарственного “кандидата”.