Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 500, № 1, стр. 488-494

Папилломавирусы ВПЧ6 и ВПЧ11 являются субтипами низкого риска канцерогенеза человека, но характеризуются тем, что вызывают аногенитальные бородавки, ларингеальные папилломатозы, кондиломы Сondyloma acuminata и др., давно известные как поражающие людей и причиняющие значительные неудобства в жизнедеятельности, снижая качество жизни и социальный статус человека. По данным ВОЗ аногенитальные папилломавирусы весьма широко распространены среди населения разных стран [1]. Кроме этого, папилломавирусы в ряду типов 11>6>16 ≠ 18 способны вызывать сложное мультигенное заболевание, именуемое возвратный (рецидивирующий) респираторный папилломатоз (RRP), впервые описанное у детей в возрасте 2–4 лет в XIX веке, протекающее внешне бессимптомно и с редкой смертностью, но неподдающееся излечению. RRP характеризуется генетической дисрегуляцией как минимум 100 генов иммунного ответа и апоптоза, что вызывает болезненную дисфункцию клеточного иммунитета (истощение макрофагов, иммунодефицит В и Т лимфоцитов и др.), и подавляющему эффективный клиринг и контроль за инфекцией ВПЧ6 и ВПЧ11 [2]. Действие аногенитальных папилломавирусов на клеточный иммунитет мало изучено и поэтому недостаточно понятно.

Поскольку эти заболевания специфически связаны с изменениями в клеточном иммунном ответе при инфекции ВПЧ, целью нашей работы было оценить изменения клеточного иммунитета в результате перорального вакцинирования мышей вакцинным материалом плодов трансгенного томата с геном HPV6 L1 в сыворотке крови и спленоцитах. Так как ранее была установлена перекрестная реакция между филогенетически неродственным антигеном ВПЧ6 L1 и антителами к ВПЧ16 L1, ВПЧ18 L1, ВПЧ31 L1 и ВПЧ45 L1 [3], было важно определить, будет ли происходить подобное перекрестное взаимодействие при активации клеточного иммуногенеза.

В результате проделанной работы впервые показано весьма значительное возрастание содержания интерферона, CD4 и CD8 Т лимфоцитов, секретируемого ими фермента апоптоза гранзима В, которое предполагает возможность эффективной пероральной вакцинации с целью активации клеточного ответа в результате иммунизации мышей вакцинным материалом с белком ВПЧ6 L1 аногенитального типа, синтезированным в растительной экспрессионной системе плодов трансгенного томата.

В работе была использована генетическая конструкция с HPV6 L1, дизайн которой и синтез были опубликованы ранее [3]. Трансформация растений томата и синтез антигенного белка ВПЧ6 L1 также представлены в нашей предыдущей работе [3], посвященной разработке высокоэффективной экспрессионной системы на основе РНК зависимой РНК полимеразы (RdRP) вируса мозаики огурца CMV. Условия содержания лабораторных мышей и методика проведения вакцинирования опубликованы ранее [4, 5].

Мыши для экспериментов были получены из вивария Восточно-Сибирского института медико-экологических исследований (г. Ангарск), работы с мышами были одобрены на заседании биоэтического совета СИФИБР СО РАН (протокол заседания № 9 от 30.10.2019 г.). При содержании мышей соблюдали стандартные условия, прописанные в ГОСТ 33215-2014, 33216-2014.

Мышей (беспородные самки возрасте 6 мес) перорально вакцинировали трижды с интервалом в один месяц вакцинным материалом плодов томата с геном HPV6 L1, при этом каждая мышь получала в среднем около 500 мкг ВПЧ6 L1. Через месяц после последней вакцинации у мышей брали кровь и выделяли селезенку. После сбора кровь до момента анализа содержали в специальных пробирках на 4 мл для хранения с напылением К2 + ЭДТА (Vacuum Blood Collection Tube, Сhina) при –62°С в низкотемпературном морозильнике. Селезенки помещали в среду DMEM в эппендорфы и на следующий день использовали для выделения спленоцитов.

Для анализа иммуногенности белка ВПЧ6 L1 использовали метод Элиспот, представляющий собой модификацию иммуноферментного анализа, позволяющий определять и количественно оценивать антиген-специфические Т лимфоциты, секретирующие определенный иммуноген, цитокин, например, IFNγ или фермент апоптоза гранзим В, локализованный в гранулах CD8 Т лимфоцитов. Для этого периферические мононуклеарные клетки крови (ПМКК) или спленоциты культивировали в присутствии антигена (индуктора) на нитроцеллюлозной мембране с адсорбированными первичными антителами, специфичными к исследуемому цитокину (или другому активатору). В результате стимуляции каждая антигенспецифическая клетка начинает продуцировать иммуноген, который связывается с иммобилизованными на мембране первичными антителами. После этого клетки отмывали фосфатно-солевым буфером и секретированные ими продукты определяли как окрашенные мелкие “пятна” (точки) на мембране с использованием конъюгированных с ферментом (щелочной фосфатазой) вторичных антител и хромогенного субстрата. Таким образом, методом Элиспот определяли количество восприимчивых к антигену иммуноген-секретирующих клеток в результате иммунной активации. Элиспот считается наиболее рекомендуемым методом для количественной оценки Т клеточного иммунного ответа при испытаниях вакцин.

В анализе использовали набор фирмы Abcam (UK) ab64029 – Murine IFNγ ELISPOT Kit (with precoated plates). Но ввиду большого количества Т лимфоцитов, выросших на мембранных дисках (диаметр 4 мм), которые трудно было просчитать, впоследствии был разработан модифицированный метод, использующий стерильные плоскодонные планшеты фирмы Corning Incorporated Costar 24 Well Cell Culture Plate Flat Bottom with Lid Tissue Culture Treated Non-Pyrogenic Polystyrene (USA) с диаметром дна лунок в 14 мм. В ламинар-боксе вырезали диски диаметром 12 мм нитроцеллюлозной мембраны Hybond™-C Extra (Membrane optimized for protein transfer) (Amersham Biosciences, UK) и помещали их на дно ячеек, в которые затем вносили по 300 мкл питательной среды DMEM (Биолот, Россия) и определенное количество микролитров суспензии периферических мононуклеарных клеток крови (ПМКК) или спленоцитов. В качестве индуктора ВПЧ6 L1 использовали 100 мкл супернатанта гомогената c ВПЧ6 L1, которые добавляли в среду DMEM перед внесением клеток крови или спленоцитов.

Спленоциты выделяли по ранее опубликованному методу [4, 5]. После измельчения селезенок полученные гомогенаты распределяли по эппендорфам и для обогащения фракции лимфоцитов центрифугировали 7 мин при 4°С и 700 об/мин. Жизнеспособность спленоцитов в супернатанте определяли с помощью 0.3% нитросинего тетразолия (Sigma, USA), а отсутствие мертвых клеток в препарате регистрировали с помощью 0.4% трипанового синего (Биолот, Россия). При подсчете (камера Горяева) с одной селезенки получали примерно 10⁷–10⁸ клеток на мл (в объеме одного эппендорфа). Дальнейшую процедуру Элиспот, включающую инкубации с антителами и промывание дисков буфером, осуществляли по протоколу набора фирмы Abcam.

В анализе Элиспот использовали следующие специфические антитела фирмы Abcam: первичные – Anti-Interferon gamma antibody recombinant rabbit monoclonal [EPR1108] ab133566; Anti-CD4 antibody [EPR19514] ab183685 recombinant rabbit monoclonal; Anti-CD8 alpha antibody [EPR21769] ab217344 recombinant rabbit monoclonal; Anti-Granzyme B antibody ab53097 rabbit polyclonal; вторичные – Goat Anti-mouse IgG H&L (Alkaline Phosphatase) ab97020. В качестве субстрата брали таблетки (0.3–0.5 таблетки на 1 анализ в 1 планшете) SIGMAFAST™ BCIP®NBT (Sigma, USA) в буфере 100 мМ NaCl, 5 мM MgCl₂, 100 мМ Трис-НСl, рН 9.5. Окрашивание наблюдали в течение 20–30 мин, после чего диски фиксировали на листе белой бумаги и фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата. Подсчет количества окрашенных “пятен” клеток осуществлялся по фотографиям на дисплее компьютера при необходимом увеличении. Окрашенное “пятно” клеток, т.е. “пятно” – образующая единица или Т клеточное “пятно”, как полагают [6], является клоном одной клетки, секретирующей индуцируемый специфический цитокин (иммуноген).

На первом этапе исследования изучали действие ВПЧ6 L1 на индукцию синтеза интерферона в клетках крови (ПМКК) и спленоцитах при разном количестве вносимой суспензии клеток в среду DMEM. Выяснилось, что нет различий в количестве прореагировавших “пятен”, т.е. выросших из Т клеток, вносимых в исходно в разной концентрации. Например, при разведении суспензий ПМКК в 5, 15, 30, 50, 70 и 100 мкл число “пятен” составило соответственно: 476 ± 60, 438 ± 18, 574 ± 70, 409 ± 11, 478 ± 14, 161 ± 0. При разведении суспензий спленоцитов в тех же количествах мкл количество “пятен” составило соответственно: 504 ± 34, 613 ± 65, 723 ± 17, 664 ± 12, 704 ± 8, 620 ± 116. В дальнейших экспериментах в лунки вносили по 30 мкл суспензий ПМКК или спленоцитов, опираясь на число “пятен” при подсчете.

На рис. 1 представлен анализ Элиспот, выполненный в точном соответствии с набором фирмы Abcam (UK) ab64029 – Murine IFNγ ELISPOT Kit. В лунки планшета (Медполимер, Санкт-Петербург) с помещенными на дно нитроцеллюлозными дисками (диаметр 4 мм) вносили суспензии ПМКК или спленоцитов в среде DMEM c антибиотиками в объеме 100 мкл, которые содержали примерно 10⁵ клеток и индуктор антигенный белок ВПЧ6 L1 (100 мкг) в соответствии с прописью фирмы Abcam. За этот период в течение трех суток размножилось на дисках довольно большое количество Т лимфоцитов, продуцирующих интерферон, лиганды CD4 и CD8 Т лимфоцитов, секретирующих гранзим В и клеток, прореагировавших с соответствующими коммерческими антителами. Как видим, произошла значительная индукция синтеза интерферона, Т лимфоцитов с лигандами CD4 и CD8. По результатам предварительного просчета их количество приближалось к числу 300–700 клеток (“пятно”-образующих единиц) на диск. В ряде контрольных дисков обнаруживаются прореагировавшие с антителами “пятна” клеток, но их количество составляло примерно 10–20 на диск. Представленные на рис. 1 данные дают основание полагать, что антигенный белок ВПЧ6 L1 способен в высокой степени активировать Т клеточный иммуногенез и вызывать индукцию синтеза интерферона, CD4, CD8 Т лимфоцитов, секретирующих значительные количества фермента апоптоза гранзима В.

Рис. 1.

Элиспот анализ индукции синтеза интерферона (IFN), CD4 и CD8 Т лимфоцитов, гранзима В (Grm B) при действии антигенного белка оболочки L1 папилломавируса аногенитального типа ВПЧ6 L1 в клетках крови (ПМКК) вакцинированных ВПЧ6 L1 мышей. Описание использованных в анализе коммерческих антител к IFN, CD4, CD8 Т лимфоцитам и гранзиму В приведены в тексте. Вариант Контроль –контроль без внесения индуктора ВПЧ6 L1 в среду DMEM, вариант + ВПЧ6 L1 – опыт с внесением индуктора ВПЧ6 L1 в среду DMEM.

Для того чтобы изучить индукцию синтеза Т клеток (Т клеточных “пятен”), использовали нашу модификацию метода Элиспот с увеличенной площадью нитроцеллюлозной мембраны для пролиферации Т клеток (рис. 2). При этом вначале использовали в качестве релевантного (контрольного и неиндукционного) белка бычий сывороточный альбумин (БСА), 3% раствор которого вносили в количестве 300 мкл в лунки планшета с 24 ячейками. Как видно из рис. 2, БСА не индуцировал синтез Т лимфоцитов.

Рис. 2.

Изучение методом Элиспот действия БСА и ВПЧ6 L1 на индукцию синтеза интерферона (IFN) в спленоцитах мышей, вакцинированных ВПЧ6 L1. Для анализа в вариантах использовали спленоциты восьми индивидуальных мышей. БСА – бычий сывороточный альбумин. Вариант Контроль + БСА – контроль без внесения ВПЧ6 L1 в среду DMEM и с добавлением БСА, вариант + ВПЧ6 L1 + БСА – внесены ВПЧ6 L1 и БСА одновременно.

Можно видеть, что увеличение площади нитроцеллюлозной мембраны, по-видимому, было благотворным для роста Т лимфоцитов и их жизнедеятельности, так как клеткам было достаточно пространства для пролиферации в виде единичных колоний, хорошо различимых визуально. Общеизвестно, что во взрослом организме содержится примерно 10¹¹ моноцитов и макрофагов, высокопластичных, не имеющих специфичности предшественников лимфоцитов. Около 4 млрд Т лимфоцитов, большей частью “наивных”, т.е. “незаряженных” антигенами, свободно циркулируют в лимфе, в крови или депонируются в селезенке. Но при инфекции и последующем воспалении в очаге (например, под нарывом) скапливаются до 1 трлн Т лимфоцитов, продуцирующих интерферон и другие цитокины, активированные для борьбы с инфекцией, причем эта противовоспалительная активация происходит в считанные часы.

Очевидно, иммунные клетки быстро растут на питательной среде DMEM, а 10–30 мкл суспензии достаточно для осуществления успешного размножения праймированных Т-лимфоцитов. Повышение дозы засеваемой суспензии приводит к снижению скорости роста из-за контактного торможения и недостатка места для пролиферации. Следует отметить, что по истечении суммарного срока всех инкубаций (примерно 7 сут) спленоциты и ПМКК все еще оставались живыми, помещенными в среду DMEM.

Из рис. 3 можно видеть, что наряду с активацией синтеза интерферона спленоциты мышей в присутствии ВПЧ6 L1 были способны формировать большие количества CD4 Т лимфоцитов и CD8 Т лимфоцитов, которые секретировали значительные количества фермента апоптоза гранзима В из внутриклеточных гранул (рис. 3). В рисунке в крайнем положении справа помещен нитроцеллюлозный диск варианта CD8, на котором выросло 2584 “пятен” клеток, хорошо различимых на фотографии и достаточно легко просчитываемых при большом увеличении на дисплее компьютера.

Рис. 3.

Изучение методом Элиспот индукции синтеза интерферона (IFN), CD4 и CD8 Т лимфоцитов в спленоцитах вакцинированных ВПЧ6 L1 мышей, а также индукции секреции фермента апоптоза гранзима В (Grm B) из гранул CD8 Т лимфоцитов. Обозначения: Контроль – контроль без индукции, + ВПЧ6 L1 – опыт, в котором внесен антигенный белок ВПЧ6 L1 для индукции активации Т лимфоцитов и секреции гранзима В. Стрелкой показан отдельный нитроцеллюлозный диск (вариант CD8) (крайний справа), на котором выявлены “пятна” клеток в просчитанном количестве 2584, прореагировавшие с антителами на CD8 Т лимфоцитов.

В наших предыдущих работах было показано, что антигенный белок ВПЧ6 L1 способен взаимодействовать с антителами филогенетически неродственных типов папилломавирусов типов 16, 18, 31 и 45 [3, 5]. Оказалось, что антигенный белок ВПЧ6 L1 также способен активировать Т клеточный иммуногенез у этих филогенетически неродственных типов 16, 18, 31 и 45 (табл. 1), так как в клетках крови (ПМКК), растущих на мембранных дисках, значительно проявилась окраска клеток с антителами на интерферон, СD4 и CD8 Т лимфоциты.

Инфицирование субтипами папилломавирусов низкого риска канцерогенеза ВПЧ6 и ВПЧ11, как полагают [2, 7], приводит к наиболее известным аногенитальным дисплазиям и к рецидивирующему (возвратному) респираторному папилломатозу. В дополнение к этому ВПЧ6 и ВПЧ11 ассоциируются с широким кругом достаточно агрессивных карцином: гортани, легких, языка, отоларингических новообразований, а также с дисплазией цервикса низкой и средней степени. Эти инфекционные заболевания трудно поддаются излечению (возврат к росту опухолей на 80% после комбинаторных способов лечения, включая хирургию, радиотерапию и хемотерапию), поэтому для их искоренения предполагают использовать многофазовые, мультикомпонентные схемы.

Одной из причин утраты устойчивости к инфекциям является “истощение” Т лимфоцитов, приводящее к разнообразным дисфункциям иммунной системы, иммунным заболеваниям, иммунодефицитам, опухолеобразованию и др. Поэтому необходимо искать инновационные пути усиления клеточного ответа для борьбы с инфекциями и иммунодефицитами.

В настоящей работе впервые показано, что антигенный белок аногенитального типа папилломавируса ВПЧ6 L1 способен активировать Т клеточный ответ в периферических клетках крови и спленоцитах, при этом значительно увеличивается количество клеток, синтезирующих интерферон, весьма возрастает число Т лимфоцитов с лигандами CD4 и CD8, активизируется секреция из гранул CD8 лимфоцитов фермента апоптоза гранзима В. Для получения этих результатов в нашей работе был применен метод Элиспот, модифицированный и значительно удешевляющий анализ по сравнению с зарубежными наборами. В зависимости от фирмы цена стандартного набора Элиспот составляет 90 000–100 000 рублей. Предложенная нами модификация анализа Элиспот требует затрат примерно в 10 раз меньше по сравнению с зарубежными аналогами, что позволяет осуществлять серийные анализы активации вакцинами иммунных ответов.

Известно, что Т клетки исключительно чувствительны к антигенной стимуляции, так как они могут уничтожать чужеродные структуры, пролиферировать и продуцировать цитокины в ответ на антигенпредставляющие клетки, приводя к образованию многочисленных комплексов гистосовместимости (MHCI и MHCII). Несмотря на то что антигенный белок ВПЧ16 L1, используемый в вакцинах Гардасил, Церварикс и Гардасил-9, охарактеризован как профилактический компонент, дальнейшие более детальные исследования показали, что ВПЧ16 L1 может вызывать также индукцию образования и накопление CD4 и СD8 Т лимфоцитов и активировать автолиз аутологичных клеток первичных опухолей цервикса, появившихся после инфекции онкогенным папилломавирусом ВПЧ16 [8]. По-видимому, судя по нашим данным [3] и данным других исследователей, если происходит индукция синтеза антител в присутствии индуктора высокоиммуногенного белка ВПЧ6 L1, то вполне вероятно, что при этом активируется и более полный Т клеточный иммуногенез, т.е. активация В лимфоцитов происходит одновременно с активацией и Т лимфоцитов.

Остановка активируемой регрессии опухолей индукторным антигеном, возможно, вызвана торможением белковыми ингибиторами контрольных точек (ИКТИ), которые уже обнаружены в большом количестве в организмах млекопитающих. Это предполагает, что клеточный иммунный ответ, формируемый данным вирусным антигеном, может иметь также и терапевтическое действие на опухоли и вызывать их регрессию впоследствии [6, 7]. Показано, что наличие или экспрессия даже ограниченного количества вирусного антигена L1 может послужить как триггер терапевтического действия и индуцировать гуморальный и цитотоксичный клеточные ответы, как на опухолях у пациентов [8], так и на моделях мышей [9].

Например, показано [10], что комбинация назального вакцинирования вакциной на основе комплекса малоразмерных пептидов ВПЧ Е6 и Е7 и белковых ингибиторов контрольных точек иммунитета (ИКТИ) приводила к значительной регрессии быстрорастущих агрессивных ротовых опухолей (орофаринкса, ротоглотки), имплантированных модельным мышам [10]. Как полагают авторы, успешность регрессии была обусловлена сочетанным и кумулятивным действием (комбинацией), вызывающим высокородственную и высокоэффективную индукцию специфического Т клеточного иммунного ответа пептидной вакциной и модальностью (модуляцией чувствительности, восприимчивости опухолевых клеток) белковых ингибиторов контрольных точек иммунного ответа. По отдельности вакцинный пептидный материал ВПЧ Е6/Е7 или белковые ингибиторы иммунных контрольных точек (ИКТИ) такой успешной регрессии не оказывали. По всей вероятности, вакцины на основе папилломавирусных высокоиммуногенных белков могли бы быть препаратами-партнерами для ИКТИ, которые при совместном действии усиливали бы противоопухолевую эффективность. Как известно, препараты из группы ИКТИ не запускают индукцию иммунного ответа “с нуля”: они лишь “растормаживают” уже инициированную иммунную реакцию, но “остановленную” белками контрольных точек [11]. Поэтому сейчас ведется направленный интенсивный поиск иммуногенных веществ, лизатов, вакцин, костимуляторных молекул, цитокинов и других компонентов иммунотерапии, которые в сочетании с ИКТИ преодолели бы контрольные точки иммунитета и оказали высокоэффективное противоопухолевое действие, вызывая регрессию. Наибольшего успеха достигли персонифицированные противораковые вакцины, т.е. разработанные с учетом индивидуальной восприимчивости опухолевых клеток определенного пациента, например, для усиления миграции Т лимфоцитов (киллеров) внутри опухоли и т.д. Полагают, что и для папилломавирусных инфекций типа кондилом, рецидивирующих дыхательных папилломатозов следует также применять “персонифицированный”, т.е. высокоспецифичный индивидуальный подход.

В случае аногенитальных папилломатозов мог бы быть прогрессивным подход для разработки вакцины с иммуногенным белком ВПЧ6 L1 и специфическим ингибитором контрольных точек иммунного ответа, тем более, что наблюдается перекрестная реакция между филогенетически неродственными типами папилломавирусов. Исследования, развиваемые в этом направлении, могли бы привести к разработке унифицированной терапевтической вакцины против папилломавирусной инфекции и против опухолеобразования, опосредованного ВПЧ.