Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2021, T. 500, № 1, стр. 483-487

Разработка новых эффективных конструкций для применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине требует поиска новых материалов и создания конструкций для обеспечения адгезии и пролиферации клеток различных типов. Для всестороннего изучения взаимодействия клеток с конструкциями необходимы разработка и внедрение новых технологических подходов для анализа микро- и наноструктурных особенностей конструкций и клеток в их составе, а также количественной оценки параметров взаимодействия клеток с поверхностью конструкций на микро- и наноуровне.

Для проведения подобных исследований в настоящий момент используются различные варианты микроскопии, такие как электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, оптическая микроспектроскопия высокого разрешения, каждый из которых обладает значительным потенциалом. Для комплексного анализа микро- и наноструктуры конструкций и клеток в их составе перспективным направлением является разработка технологии, комбинирующей различные техники микроскопии для коррелятивных исследований [1]. Такой подход позволяет проводить коррелятивные исследования с высоким разрешением, что дает возможность получить новую уникальную информацию о микро- и наноструктуре и свойствах биологических объектов.

Нами разработана уникальная технология сканирующей оптическо-зондовой нанотомографии (СОЗНТ), комбинирующая ультрамикротом и сканирующий зондовый микроскоп (СЗМ) в одном устройстве в корреляции с методами флуоресцентной оптической микроскопии [2]. Использование методики СОЗНТ позволяет изучать трехмерную микро- и наноструктуру конструкций на основе биосовместимых материалов, клеток, тканей и тканеинженерных конструкций, в корреляции с исследованием локализации флуоресцентных маркеров в объеме изучаемых образцов. В том числе разработанный метод может быть успешно использован для определения параметров трехмерной наноморфологии биодеградируемых скаффолдов с культивированными клетками.

Ниже представлены исследования образцов клеток линий мышиных фибробластов 3Т3 и гепатокарциномы человека Hep-G2 на скаффолдах из фиброина шелка. Конструкции для культивирования клеток получали из фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori. Данный материал обладает уникальным сочетанием свойств, которые позволяют получать конструкции с различной структурой на его основе для применения во множестве областей регенеративной медицины и тканевой инженерии [3–5]. Биосовместимость конструкций на основе фиброина шелка обеспечивает эффективное культивирование клеток, в том числе, адгезию клеток, а физико-химические свойства конструкций позволяют проводить различные манипуляции для пробоподготовки образцов для СЗОНТ, что позволяет рассматривать их как перспективные подложки для проведения исследований методом СЗОНТ. Скаффолды в виде пленок на основе фиброина шелка для культивирования клеток были получены по протоколу, описанному в [6].

В экспериментах использовали клеточные линии мышиных фибробластов 3T3 и гепатокарциномы человека Hep-G2. Для получения образцов с клетками для исследований методом СЗОНТ суспензию клеток в среде инкубации переносили в подготовленные лунки 48-луночных планшетов из расчета 2000 клеток на лунку в 500 мкл среды инкубации. Планшеты инкубировали в термостате при 37°С и 5% CO₂.

Для исследований клеток на скаффолдах методом флуоресцентной СЗОНТ клетки предварительно окрашивали флуоресцентными красителями FITC и DAPI. В ходе получения образца для СОЗНТ производили дегидратацию образцов скаффолдов с адгезированными клетками проводкой по спиртам с увеличивающейся концентрацией и заливку образцов в эпоксидную среду [3].

Трехмерный СЗОНТ-анализ образцов выполнялся с использованием специализированного СЗМ, комбинированного с ультрамикротом Leica EM UC6 (Leica Microsystems GmbH, Австрия) для сканирующей зондовой нанотомографии [2]. Данная уникальная научная установка – система зондово-оптической 3D-корреляционной микроскопии (http://ckp-rf.ru/usu/486825/), созданная с участием авторов настоящей работы, – позволяет выполнять серийные СЗМ-измерения наноструктуры поверхности объектов непосредственно после последовательных сверхтонких срезов образца ультрамикротомом в корреляции с флуоресцентной оптической микроскопией той же области среза образца.

На рис. 1а–1в представлены результаты коррелятивных измерений клетки Hep-G2 – флуоресцентные изображения высокого разрешения, отображающие окрашивания DAPI и FITC и СЗМ-изображение того же участка клетки, адгезированной на скаффолд. Полученные изображения позволяют выделить оформленное ядро, занимающее значительный внутренний объем клетки, внутри которого выделяются области хроматина, а также белковые структуры. Анализ поверхности среза при помощи СЗМ позволяет значительно повысить разрешение по сравнению с оптическими методами. Полученные коррелятивные флуоресцентные и СЗМ-изображения фибробласта представлены на рис. 1е–1з. По результатам коррелятивного анализа помимо ядра в клетке были обнаружены множественные включения белковой природы.

Рис. 1.

Анализ образцов клеток гепатокарциномы человека Hep-G2 и фибробластов 3Т3, культивированных на скаффолдах в виде пленок на основе фиброина шелка. а – флуоресцентное изображение поверхности среза скаффолда с адгезированной клеткой Hep-G2, окрашивание DAPI, увеличение ×1000, размерный отрезок – 5 мкм; б – коррелятивное флуоресцентное изображение той же области, окрашивание FITC; в – коррелятивное СЗМ-изображение топографии поверхности среза в той же области, размер скана 32 × 20 мкм, диапазон вариации высоты 9 нм. г – Трехмерная СЗНТ-реконструкция фрагмента клетки гепатокарциномы человека Hep-G2, адгезированной на скаффолд, 32.0 × 22.0 × 3.6 мкм, толщина среза 150 нм, размерный отрезок 5 мкм. Стрелка указывает плоскость сечения, соответствующую СЗМ-изображению, приведенному на панели В. д – Трехмерная СЗНТ-реконструкция фибробласта, адгезированного на скаффолд, 31.0 × 25.0 × 2.4 мкм, толщина среза 150 нм, размерный отрезок 5 мкм. Стрелка указывает плоскость сечения, соответствующую СЗМ-изображению, приведенному на панели З. е – флуоресцентное изображение поверхности среза скаффолда с адгезированным фибробластом, окрашивание DAPI, увеличение ×1000, размерный отрезок – 5 мкм; ж – коррелятивное флуоресцентное изображение той же области, окрашивание FITC; з – коррелятивное СЗМ-изображение топографии поверхности среза в той же области, размер скана 32×15.4 мкм, диапазон вариации высоты 15 нм.

Для трехмерных реконструкций фрагментов фибробласта и клетки гепатокарциномы человека Hep-G2 было получено соответственно 16 и 24 последовательных СЗМ-изображений участков скаффолдов с адгезированными клетками после последовательных срезов образца толщиной 150 нм. Полученные при помощи программного пакета Image Pro Plus 6.0 3DConstructor (MediaCybernetics Inc.) визуализации трехмерной структуры фибробласта и клетки гепатокарциномы человека Hep-G2 показаны на рис. 1г, 1д.

Совокупность данных, полученных в результате трехмерной реконструкции методом СЗОНТ, дает возможность вычислить ряд морфологических параметров изучаемых клеток, таких как средняя шероховатость поверхности клетки R_a, эффективная площадь поверхности σ и длина автокорреляции поверхности клетки L₁. Разработанные нами алгоритмы вычисления этих параметров на основе данных СЗНТ подробно описаны в [7]. Стоит отметить, что данные трехмерные параметры невозможно вычислить из двумерных данных, получаемых при помощи стандартных методов СЗМ, флуоресцентной или электронной микроскопии. Шероховатость поверхности клеточной мембраны является важным цитологическим параметром, задействованным в ряде клеточных механизмов, включая клеточную подвижность, адгезию и межклеточные контакты [8–10]. Она может служить чувствительным индикатором состояния клетки [11–13].

Параметры σ и L₁ характеризуют степень развитости и характерные латеральные размеры особенностей рельефа поверхности клетки соответственно. Данные параметры также важны для оценки состояния и биологической активности клетки [14].

Также использованный метод позволяет вычислить максимальную толщину адгезированной клетки как высоту поверхности клетки над поверхностью скаффолда h. Параметры, полученные в результате анализа трехмерных структур фибробласта и клетки гепатокарциномы человека Hep-G2, адгезированных на поверхность скаффолда на основе фиброина шелка, представлены в табл. 1.

Необходимо отметить, что для проанализированной клетки гепатокарциномы человека Hep-G2 количественные параметры, характеризующие степень шероховатости и развитости ее поверхности, значительно ниже, чем для фибробласта, адгезированного на аналогичный скаффолд на основе фиброина шелка. Это может быть связано с тем, что данная клетка плотнее адгезирует к субстрату. Полученные данные позволяют оценить также объем ядра клетки Hep-G2 на уровне 940 ± 100 мкм³, что составляет 7.3 ± 1.5% от общего объема клетки.

Разработанная технология исследования трехмерных характеристик наномасштабной морфологии фибробластов и клетки гепатокарциномы человека Hep-G2, адгезированных на биодеградируемые скаффолды на основе фиброина шелка, с использованием принципов сканирующей оптическо-зондовой нанотомографии применима для исследования особенностей трехмерной микро- и наноструктуры клеток и клеточно-инженерных конструкций различных типов.