Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 502, № 1, стр. 43-47

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа была выполнена на стерильной культуре живых клеток Paramecium caudatum, которых содержали в приближенных к естественной среде условиях обитания при температуре 24 градуса при pH = 6.8—7.2 с соблюдением 12-часового светового дня и поддержанием плотности в размере 600 клеток/мл. Кормление инфузорий производилось ежедневно в объеме 200 мкл на колонию в 100 мл. В качестве корма использовался раствор дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Для поддержания стерильности среды проводилась ежемесячная фильтрация колонии через мелкодисперсную губку. В день эксперимента кормление инфузорий приостанавливалось.

Для верификации предложенного нами метода исследования особенностей влияния фармакологических веществ на Paramecium caudatum были выбраны дофамин и адреналин, чьи концентрации после введения в исследуемый объем культуры (1 мл) составляли 10^–10 моль/мл для дофамина и 10^–8, 10^–10 ,10^–12 моль/мл для адреналина. Так же для определения, через какие адренорецепторы альфа или бета действует адреналин на парамеций, были применены неселективные адреноблокаторы: ницерголин и тимолол в концентрации 10^–10 моль/мл.

Регистрация движения клеток велась с использованием тринокулярного стереоскопического микроскопа Olympus SZ6. Для анализа двигательной активности, по полученным видеозаписям, использовалась программа ImageJ (Fiji) плагин “Track Mate” [5].

Статистический анализ проводился в программе “Statistica 10” с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни после проверки на нормальность критерием Шапиро–Уилка для больших выборок. Достоверные значения оценивались при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В контрольной группе животные распределялись по всему исследуемому объему, двигаясь с одинаковой скоростью и выдерживая преимущественно линейную траекторию плавания рис. 1а. После добавления адреналина в среду наблюдается снижение двигательной активности, которое становится прерывистым и нелинейным рис. 1б.

Рис. 1.

Возможные стратегии поведения парамеций в ответ на введение адреналина в концентрации (10^–10 моль/мл).

а – поведение клеток контрольной группы (после внесения воды), б – проявление хемотаксиса после введения адреналина.

Показатели уменьшения скорости под воздействием адреналина относительно контроля приведены на рис. 2а.

Рис. 2.

Изменение скорости движения и активности Paramecium caudatum в ответ на предъявление адреналина в концентрации (10^–10–10^–12моль/мл). а – График изменения скорости (после введения адреналина на 5-й минуте регистрации). б – График изменения количества активных клеток после воздействия адреналина (активными клетками считаются все подвижные клетки в эксперименте).

При регистрации характера движения парамеций в контрольных экспериментах было показано, что подавляющее число животных (95%) двигается прямолинейно, проходя за 40 мин опыта около 150 см (рис. 2а). При этом скорость движения парамеций в течение всего времени регистрации оставалось постоянной. Введение в среду адреналина привело к снижению скорости движения и уменьшению пробега, пройденного за время эксперимента.

Такой поведенческий эффект обусловлен наличием на мембране Рaramecium caudatum рецепторов к адреналину [6]. Вследствие активации этих рецепторов происходит деполяризация мембраны, что и приводит к снижению двигательной активности животного (рис. 2), т.к. скорость движения клеток по литературным данным напрямую зависит от потенциала на мембране [7].

Снижение активности клеток из опытной группы может быть связанно с активацией внутриклеточных процессов, таких как расщепление гликогена, эндоцитоз, конъюгация, пролиферация (рис. 2б).

Однако совсем иная картина отмечается после внесения в среду дофамина (рис. 3).

Рис. 3.

Изменение скорости движения и активности Рaramecium caudatum в ответ на предъявление дофамина в концентрации (10^–10 моль). а – График изменения скорости (после введения дофамина на 5-й минуте регистрации). б – График изменения количества активных клеток после воздействия дофамина (активными клетками считаются все подвижные клетки в эксперименте).

На графиках показано, что внесение в среду дофамина, в концентрации 10^–10 моль/мл, не влияет на двигательную активность исследуемой модели в отличие от адреналина, предъявляемого в той же концентрации. Такой результат обусловлен отсутствием дофаминовых рецепторов на мембране Рaramecium caudatum.

Теперь рассмотрим влияние эндогенного адреналина, выделяемого клетками, на конкретные адренорецепторы, добавив в среду неселективные адреноблокаторы для каждой группы рецепторов (рис. 4).

Рис. 4.

Изменение скорости движения Paramecium caudatum в ответ на предъявление ницерголина и тимолола в концентрации (10^–10 моль/мл). а – График изменения скорости после введения ницерголина (альфа блокатора), б – График изменения скорости после введения тимолола (бета блокатора).

В случае с предъявлением ницерголина эндогенный адреналин воздействует на бета-1 и бета-2 адренорецепторы, т.к. данный препарат является неселективным альфа блокатором. Это приводит к сильному снижению скорости движения парамеций (рис. 4а), такой ответ может быть связан с тем, что активация б1 и б2 рецепторов направлена на деполяризацию клеточной мембраны. Однако противоположную картину в изменении скорости можно увидеть при добавлении в среду тимолола, где эндогенный адреналин будет воздействовать уже на а1 и а2 адренорецепторы, т.к. бета рецепторы будут уже заблокированы (рис. 4б). В этом случае наблюдается характерный двухфазный ответ. Так, в течение 5 мин после введения препарата видим воздействие адреналина на а1 рецепторы, что приводит к снижению скорости, т.к. данный тип рецепторов так же является деполяризующим, как и б1, б2. Однако через 14 мин после предъявления тимолола скорость клеток возрастает. Такой ответ обусловлен активацией а2 рецепторов, которые направлены на гиперполяризацию мембраны и ингибируют секрецию адреналина в среду. Возможно, видимые различия в силе воздействия адреналина на а1 и а2 рецепторы объясняются разным количеством этих рецепторов на мембране или различной чувствительностью.

Из полученных нами данных следует, что физиологические реакции парамеций перспективны с позиций познания процессов функционирования медиаторных механизмов [8].

Таким образом, в представленном исследовании показано, что при воздействии адреналина наблюдается снижение двигательной активности клеток, в то время как при отсутствии рецепторов к дофамину параметры двигательной активности не имеют отличий от контрольных значений.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе показана возможность использовать Рaramecium caudatum в качестве доклинической модели при первичном скрининге фармацевтических препаратов, регистрируя изменение двигательной активности этого одноклеточного организма в ответ на активацию рецепторов разных типов, расположенных на клеточной мембране. Метод позволяет выявлять сродство к известным клеточным рецепторам парамеций, что позволяет дать оценку спектру фармакологического влияния исследуемых препаратов.