Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 502, № 1, стр. 37-42

ВВЕДЕНИЕ

Моделирование септопластики у крыс приводит к развитию мощного стрессового ответа [1]. На примере животных это позволяет нам понять то, какие процессы возможны при проведении подобных хирургических вмешательств [2]. Моделирование стрессовых воздействий приводит к нарушению функционального состояния нейронов с последующими морфологическими изменениями [3]. Особое внимание при стрессе уделяется гиппокампу [4, 5]. Белок p53 является активатором транскрипции определенного набора генов-мишеней, ингибирующим клеточный цикл регуляторным фактором и эффектором клеточных ответов на повреждения, которые включают остановку клеточного цикла и апоптоз [6]. Вместе с тем р53 является нейропротектором в модели тауопатии in vivo. Было показано, что р53 контролирует транскрипцию группы генов, участвующих в синаптической функции. Транскрипционный контроль р53 этих синаптических генов сохраняется в мышиных нейронах и человеческом мозге [7]. Поврежденные (темные) нейроны имеют специфические морфологические признаки: усохшая цитоплазма, сморщенное ядро с сегментированным хроматином и неровными границами, штопорообразный аксон [4, 8]. Считается, что в этих нейронах произошел запуск запрограммированной гибели клеток [9]. Однако не исключается, что темные нейроны при определенных условиях способны к восстановлению своего морфофункционального состояния [8].

Нейроны его пирамидного слоя чувствительны к различным стрессовым факторам, в том числе и при хирургическом стрессе. Так было показано, что моделирование хирургических манипуляций в полости носа у крыс провоцирует экспрессию белка p53 в нейронах гиппокампа и появление темных нейронов. При этом исследований, оценивающих одновременность этих процессов при моделировании септопластики у крыс, не проводилось.

В настоящем исследовании цель исследования заключалась в определении взаимосвязи появления p53-позитивных нейронов и темных нейронов в гиппокампе у крыс после хирургических вмешательств на перегородке носа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Двадцати половозрелым крысам-самцам линии Wistar массой 205.25 ± 10.15 г. было проведено моделирование септопластики стандартным методом путем зигзагообразной скарификации слизистой оболочки полости носа (рис. 1а) [10].

Рис. 1.

(а) Схема проведения моделирования септопластики. Стрелками указано направление скарификации слизистой перегородки носа. (б) Расположение субполей гиппокампа крысы. Иммуногистохимическая реакция анти-p53. Докрашивание гематоксилином Майера. Ув. ×100.

Пять крыс составили контрольную группу. За 10 мин до операции 15 крысам, которые составили экспериментальную группу, в целях общей анестезии внутрибрюшинно вводили раствор золетила 100 в дозировке 15 мг/кг. В экспериментальной группе крыс гуманную эвтаназию проводили на 2-е, 6-е и 14-е сутки после операции по 5 особей путем введения летальных доз золетила 100. Фиксацию головного мозга всем крысам проводили до трепанации черепа 10% раствором формалина в течение 5–10 мин. После трепанации черепа головной мозг фиксировали 10% раствором формалина, после чего заключали в парафиновые блоки. У каждой крысы получали 8 срезов головного мозга во фронтальной плоскости толщиной 4 мкм, которые окрашивали антителами к белку р53 с докрашиванием гематоксилином Майера и толуидиновым синим по Нисслю. Изучали субполя гиппокампа СА1, СА2, СА3 и зубчатую извилину (DG) (рис. 1б). В пирамидном слое субполей подсчитывали абсолютное количество нейронов, у которых была положительная ядерная реакция с антителами к белку p53, а также количество темных нейронов.

Полученные данные с помощью методов подсчета клеток были представлены как среднее значение ±SE. Затем их сравнивали между обеими группами с помощью t-теста с SPSS 21software.

Работа была выполнена в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и ее пересмотренным вариантом 2000 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Согласно критерию Манна–Уитни, в СА1 количество p53-позитивных нейронов достоверно повысилось на 2-й, 4-й (p < 0.001) и 6-й дни (p < 0.05) после проведения моделирования септопластики, по сравнению с контрольной группой (рис. 2).

Рис. 2.

P53-позитивные нейроны (а, в, д) (желтые стрелки, окр. мышиными моноклональными антителами к белку p53, ув. ×600) и темные нейроны (б, г, е) (синие стрелки, окр. толуидиновым синим по Нисслю, ув. ×400) в гиппокампе у крыс на 2-й (а, б), 4-й (в, г) и 6-й дни (д, е) после моделирования септопластики. Примечание: зелеными стрелками обозначены нормальные нейроны.

В динамике пик роста экспрессии белка p53 в цитоплазме нейронов СА1 и СА2 гиппокампа пришелся на 2-4-е сутки, а на 6-й день количество этих нейронов значимо снизилось (p < 0.001). В СА2 на 6-й день по p53-позитивным нейронам экспериментальная группа не отличалась от контрольной (рис. 3а). В СА3 на всех сроках после хирургического вмешательства было отмечено повышение экспрессии белка p53, по сравнению с контрольной группой (p < 0.001). В DG, по сравнению с контролем, количество p53-позитивных нейронов было значимо выше на всех сроках оценки. Пик численности этих клеток пришелся на 4-й день, по сравнению с остальными сроками (p < 0.001) (рис. 3а).

Рис. 3.

Динамика изменения количества p53-позитивных нейронов (p53) (а) и темных нейронов (б) при моделировании септопластики. Примечание: * – достоверные различия между данными контрольной группы и сроками после операции (p < 0.001); ∨ – достоверные различия между данными контрольной группы и сроками после операции (p < 0.05); † – достоверные различия между сроками после операции внутри экспериментальной группы (p < 0.001); ^‡ – достоверные различия между сроками после операции внутри экспериментальной группы (p < 0.05).

По количеству ТН в пирамидном слое гиппокампа в экспериментальной и контрольной группах распределение данных было не гауссово. В СА1 количество ТН на 2-й и 4-й дни достоверно не отличалось от контроля, но на 6-й день после операции было отмечено снижение их количества (p < 0.001) (рис. 2). В СА2 экспериментальная группа от контрольной значимо не различалась. Через 2 сут после операции был отмечен минимум количества ТН, по сравнению с 4-м днем (p < 0.001). В СА3 на 4-й день после операции наблюдался пик численности ТН, по сравнению с остальными днями (p < 0.001). В контроле количество ТН не отличалось от 2-го дня, но было достоверно ниже, по сравнению с 4-м (p < 0.001) и 6-м (p < 0.05) днями после операции (рис. 3б). В DG наблюдались схожие с СА3 результаты (рис. 3б).

Сопоставляя количество нейронов, в которых белок p53 экспрессировался в цитоплазму, и количество темных нейронов, была обнаружена положительная сильная связь на всех сроках оценки и во всех субполях гиппокампа (рис. 4). Самый низкий коэффициент детерминации был обнаружен при оценке субполя СА2 на 4-й день после операции (рис. 4е).

Рис. 4.

Корреляция между количеством темных нейронов (ТН) и количеством p53-позитивных нейронов (p53) в субполях гиппокампа СА1 (а–в), СА2 (г–е), СА3 (ж–и) и DG (к–м) на 2-й (а, г, ж, к), 4-й (б, д, з, л) и 6-й (в, е, и, м) дни после моделирования септопластики.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Апоптоз нейронов возникает при различных физиологических и патологических процессах и является генетически контролируемой формой гибели клеток [11]. Формирование темных нейронов в СА1 и СА3 гиппокампа крыс в настоящем исследовании, по-видимому, является типовой реакцией на стресс, в том числе и сопровождающийся воспалительными реакциями. Так, ранее было показано, что при моделировании острого перитонита у свиней и крыс в субполях CA1 и CA2 также наблюдается образование темных нейронов [12]. Это связывают с запуском механизмов апоптоза, так как рост количества ТН коррелирует с положительными TUNEL-нейронами [13]. Другие исследования также подтверждают, что сморщивание нейрона и его базофилия могут служить надежными критериями начинающейся его дегенерации [12]. Белок p53 активируется клеточным стрессом и повреждением ДНК и, в зависимости от тяжести стресса и конкретного типа клеток, может способствовать адаптивным ответам на стресс или может запускать остановку клеточного цикла или апоптоз [14]. Когда нормальные пролиферирующие клетки подвергаются повреждению ДНК, они реагируют одним из двух способов: остановка клеточного цикла или апоптоз, и р53 участвует в обоих этих процесcах [15]. Кроме широко изученной роли p53 как регулятора запуска апоптоза, была продемонстрирована и его нейропротективная роль [16]. Дефицит р53 приводит к более медленной пролиферации нейрональных стволовых клеток, потенциально из-за длительной фазы G2 [17]. Кроме того, было показано, что р53 служит для смягчения нарушения развития нейронов после облучения и, таким образом, может играть существенную роль в регулировании поздних эффектов в мозге после проведения радиотерапии [18]. Показано, что p53 регулирует некротическую гибель и аутофагическую активность нейронов [19]. В предыдущих исследованиях нами было продемонстрировано, что при моделировании септопластики в гиппокампе у крыс встречаются нейроны, в которых белок p53 появляется как исключительно в цитоплазме, так и в ядре. В последнем случае нейроны носили характерные морфологические признаки дегенерации – склеивание хроматина, нечеткость границ ядра, а в ряде случаев – распад клетки [4]. Можно предположить, что p53 может и не носить исключительно роль регулятора апоптоза.

Ранее также было показано, что темные нейроны могут как восстанавливать свое морфо-функциональное состояние за счет увеличения цистерн гранулярной эндоплазматической сети с образованием мембранных завитков, переходом этого процесса на астроцитарные отростки и, как следствие, с последующим снижением степени структурного уплотнения клетки [8], так и быть признаком конечного некротического распада клетки не зависимо от причины гибели нейрона, в том числе и от различных биохимических каскадов апоптоза [9]. Запуск апоптоза и/или повреждение нейронов гиппокампа в дальнейшей перспективе может привести к различным нейробиологическим последствиям – нарушению памяти, поведенческих реакций и др. [20]. Ранее нами было показано, что моделирование септопластики у крыс провоцирует повышение тонуса симпатической нервной системы и концентрации кортикостерона в плазме крови в течение первых 4–5 дней после операции [20], что косвенно свидетельствует о наличии причинно-следственных связей между нарушением баланса вегетативной нервной системы, активацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, появлением “темных” и p52-позитивных нейронов в пирамидном слое гиппокампа и, как следствие, нарушений поведенческих реакций [20]. Кроме того, в предыдущих исследованиях нами были получены результаты, демонстрирующие, что при данном виде хирургических вмешательств развивается тревожное состояние у крыс [10], что можно связать не только с развитием общих воспалительных реакций, но и с сенсорной депривацией периферического отдела обонятельного анализатора [6].

Обнаруженные нами в настоящем исследовании высокие коэффициенты детерминации подтверждают теорию того, что вероятнее всего появление темных нейронов в гиппокампе и зубчатой извилине тесно связано с экспрессией белка p53 при хирургическом стрессе, спровоцированном моделированием септопластики у крыс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Появление темных и p53-позитивных нейронов в гиппокампальной формации у крыс после моделирования септопластики является типовыми ответными реакциями нервной ткани на стресс. Очевидно, что экспрессия белка p53 связана с базофилией цитоплазмы нейронов, их морфофункциональным состоянием. Предположительно белок p53 может запускать не только активацию поврежденных нейронов в гиппокампе, но и играть нейропротективную роль. Предстоящие исследования должны определить роль белка p53 в дальнейшей судьбе поврежденных нейронов в пирамидном слое и дифференцировать механизмы его экспрессии.