Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 502, № 1, стр. 28-31

Архитектура хромосом и дистанционные взаимодействия между регуляторными элементами являются одной из ключевых областей исследований в современной биологии. В настоящее время стало очевидно, что для установления правильной экспрессии генов их регуляторные элементы специфично взаимодействуют друг с другом [1]. Недавно полногеномные 3D-исследования показали, что хромосомы высших эукариот организованы в топологически ассоциированные домены (ТАД) [2]. В организации границ ТАДов у позвоночных определяющую роль играет архитектурный белок СTCF, который до настоящего времени является единственным хорошо исследованным инсуляторным белком млекопитающих [3].

Одной из наиболее удобных моделей для изучения организации пространственных специфичных взаимодействий между регуляторными элементами in vivo является Bithorax-комплекс (ВХ-С) Drosophila melanogaster, состоящий из трех гомеозисных генов Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abd-A) и Abdominal-B (Abd-B), отвечающих за формирование третьего грудного (Т3) и всех брюшных сегментов (А2-А7) [4–6]. Эти гены регулируются тканеспецифичными регуляторными доменами (abx/bx, bxd/pbx, iab-2–iab-8), чередующимися в порядке расположения сегментов, которые они контролируют (рис. 1а). Каждый домен отвечает за экспрессию одного из трех генов и функционирует автономно благодаря окружающим его границам-инсуляторам [7, 8]. В настоящее время наиболее подробно исследована регуляторная область гена Abd-B, представленная доменами iab-5–8, которые фланкированы границами Mcp, Fab-6, Fab-7 и Fab-8 [4–6] (рис. 1а). Рядом с границами находятся регуляторные элементы, рекрутирующие Поликомб-комплексы, PRE (Polycomb response element) [9, 10]. На примере Fab-7 и Fab-8 было показано, что границы имеют две функции: поддерживают автономию соседних iab-доменов и одновременно обеспечивают специфичные взаимодействия между iab-доменами и промотором Abd-B [11]. На границах Mcp, Fab-6 и Fab-8 были найдены сайты связывания для гомолога белка CTCF млекопитающих (dCTCF), а на границах Fab-7 и Mcp – архитектурного белка Pita [12, 13].

Рис. 1.

(а) Схема регуляторной области генов abd-A и Abd-B. Синяя и зеленая стрелки представляют транскрипты генов abd-A и синие оттенки – регуляторная область гена Abd-B соответственно. Фигурными скобками обозначены iab-домены, содержащие сегмент-специфичные энхансеры (синие оттенки – регуляторная область гена abd-A, зеленые оттенки – регуляторная область гена Abd-B). Вертикальными черными линиями отмечены границы (Fub, Fab-3, Fab-4, Mcp, Fab-6, Fab-7 и Fab-8) регуляторных доменов iab-2 – iab-8,9, которые ответственны за регуляцию генов и за дифференцировку сегментов T3-A8. Сайты связывания dCTCF на границах показаны кружками красного цвета. Ниже показана карта области границы Fab-7, которая удалена в платформе Fab-7^attP50 и заменена на сайты attP, lox и frt. Сайты гиперчувствительности, HS*, HS1 и HS2, показаны серыми прямоугольниками, а HS3, который является сайленсером PRE^iab-7 – голубым. (б) Фотографии кутикулы брюшек самцов в светлом и темном поле: wt (дикий тип), Fab-7^attP50, F4 ry, F3 ry, F4, F3, F4+PRE^iab-7 и F3+PRE^iab-7. У взрослых самцов wt сегмент A7 отсутствует, стернит сегмента А6 имеет форму банана и лишен щетинок, а стернит А5 имеет четырехугольную форму и покрыт щетинками. Тергит A6 имеет трихомы (темное поле) только вдоль переднего и вентрального краев, в то время как весь тергит A5 почти полностью покрыт трихомами. У самцов Fab7^attP50 A6 отсутствует. Сегмент A6 линий F3 ry и F4 ry лишен стернита – частичное превращение в А7, но имеет деформированный тергит, однако распределение трихом указывает на частичную трансформацию в А5. В линиях F3 и F4 вновь наблюдается полное исчезновение А6. В случае F4+PRE^iab-7 и F3+PRE^iab-7 стернит отсутствует, а тергит заметно уменьшен в размерах, но имеет посторонние трихомы, что указывает на трансформацию в А5.

Целью настоящего исследования является попытка идентификации границ в регуляторной области гена abd-A. Ранее в регуляторной области гена abd-A были найдены участки, соответствующие потенциальным границам Fab-3 и Fab-4, окружающим домен iab-3, содержащие два (Fab-3) и один (Fab-4) сайта связывания белка dCTCF [12]. Ранее было показано, что фрагменты ДНК Fab-3 (626 пн), F3, (3R:16835097..16834472) и Fab-4 (784 пн), F4 (3R:16857582..16856799, координаты указаны в соответствии с Genome Release r6.41, FlyBase), несмотря на наличие сайтов dCTCF, не обладают свойствами инсуляторов на стадии имаго при исследовании в трансгенных линиях дрозофилы на модельных регуляторных системах генов yellow и white [14]. Однако четыре сайта dCTCF также не блокируют энхансеры генов yellow и white, но, находясь в регуляторной области гена Abd-B вместо границы Fab-7, эффективно изолируют домен iab-6, который обеспечивает формирование сегмента A6, от iab-7, отвечающий за лизис сегмента А7 у взрослых самцов мух [15, 16]. Поэтому можно ожидать, что фрагменты F3 и F4 также могут формировать границу в контексте BX-C. Для исследования этого вопроса была использована созданная ранее платформа Fab-7^attP50, в которой граница Fab-7 заменена на сайты attP и frt (рис. 1а) [17, 18]. Граница Fab-7 состоит из четырех сайтов гиперчувствительности к ДНКзе I: HS* + HS1 + HS2, формирующие инсулятор, и HS3, считающийся сайленсером PRE^iab-7 [10].

В линии Fab-7^attP50 удалены все четыре сайта. что приводит к преждевременной эктопической активации домена iab-7 инициатором iab-6 во всех клетках PS11, в результате чего сегмент А6 у самцов лизируется (рис. 1б), а у самок трансформируется в А7. На основе плазмиды pBluKS были созданы конструкции, содержащие сайт attB для интеграции в нужное место генома по сайту attP, фрагменты F3, или F4, frt-сайт для последующего вырезания репортера и последовательностей плазмиды, и репортерный ген rosy (ry), для отбора позитивных событий. Полученные конструкции были инъецированы в эмбрионы линии ry^- Fab-7^attP50, которая на Х-хромосоме содержит конструкцию, экспрессирующую интегразу φс31 на стадии пребластодермы [18]. Выжившие мухи были скрещены с линией yw; TM2/MKRS, несущей мутации гена ry. Положительные события интеграции в платформу были отобраны по восстановлению окраски глаз трансгенным геном ry до дикого типа.

В результате были созданы линии: F3 ry и F4 ry. В обоих случаях наблюдалось слабое восстановление функций границы, что проявлялось неполным формированием сегмента А6: тергит был деформирован, а стернит либо не развивался, либо представлял собой небольшие островки клеток (рис. 1б). Характер распределения трихом на тергите и щетинки на остатках стернита свидетельствуют, что клетки А6 в этих линиях имеют спецификацию сегмента А5. Это свидетельствует о том, что в данных тканях происходит изоляция iab-6 не только от iab-7, но и от промотора гена Abd-B. Однако после делеции ry в результате Flp-индуцированной рекомбинации между сайтами frt, в линиях F3 и F4 происходили полный лизис сегмента А6 у самцов (рис. 1б) и превращение А6 в А7 у самок, что предполагает полную потерю инсуляции. Так как сам ген ry не формирует границу между iab-6 и iab-7, можно заключить, что в линиях F3 ry и F4 ry фрагменты F3 и F4 кооперируют с геном ry в формировании границы в отдельных клетках сегмента А6. Наиболее вероятно, что в этом процессе участвует промотор гена ry. Таким образом, исследуемые фрагменты F3 и F4 обладают очень слабой инсуляторной активностью. Важно отметить, что фрагменты F3 и F4, встроенные вместо Fab-7, приводили к стерильности самцов и самок. В этой связи можно отметить, что половой аппарат гомозиготных самцов в обоих линиях повернут на 30–180°. Кроме того, как в линии F3, так и в линии F4, наблюдалось значительное снижение выживаемости гомозигот. При скрещивании гетерозиготных самок и самцов, находящихся на балансере MKRS, либо TM2, вместо ожидаемых в потомстве ~33% выживало не более 5% гомозигот с задержкой развития (вылуплялись гораздо позже по сравнению с диким типом), а при снижении температуры до +18°С гомозиготы как F3, так и F4, вообще не обнаруживались.

Ранее для границ Fab-6 и Fab-7 было показано, что PRE, расположенные в доменах iab-6 и iab-7, участвуют в формировании эффективных границ [19, 20]. Для исследования возможного участия PRE в активности границ регуляторной области аbd-A были созданы конструкции, в которых к фрагментам F3 и F4 был добавлен PRE^{iab- 7} (227 bp) (рис. 1а), и были получены трансгенные линии, в которых Fab-7 был заменен на F3+PRE^iab-7ry и F4+PRE^iab-7ry. Однако в полученных линиях после вырезания ry по сайтам frt полного восстановления границы между iab-6 и iab-7 не наблюдалось. Фенотип мух линий F3+PRE^iab-7 и F4+PRE^iab-7, после вырезания ry, напоминал фенотип линий F3 ry⁺ и F4 ry⁺ (рис. 1б). Таким образом, PRE^iab-7 лишь частично усиливает слабую инсуляторную активность фрагментов F3 и F4 в отдельных клетках сегмента А6.

Полученные результаты показывают, что сайты СTCF в составе 626 пн фрагмента F3 и 784 пн фрагмента F4 не формируют сильных инсуляторов, в отличие от содержащего два сайта связывания белка dCTCF 337 пн фрагмента границы Fab-8, который полностью блокировал взаимодействие между доменами iab-6 и iab-7 [15]. Эти результаты согласуются с выводами о том, что неизвестные архитектурные белки совместно с dСTCF участвуют в формировании сильных границ BX-C [13]. Можно предположить, что в районе iab-3 – iab-4 сильные инсуляторы в составе границ не нужны, что связано с особенностями регуляции в этой области. В то же время замещение границы Fab-7 фрагментами границ Fab-3 или Fab-4 негативно влияет на жизнеспособность и фертильность мух. Это может быть связано со способностью этих границ формировать неправильные контакты со своими эндогенными копиями, что нарушает правильную работу генов abd-A и Abd-B. Это предположение требует дальнейшего исследования.