Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 503, № 1, стр. 189-191

Пандемия коронавируса SARS-CoV-2 продемонстрировала актуальность разработки новых противовирусных препаратов. Классические ингибиторы вирусной активности представляют собой низкомолекулярные соединения, способные встраиваться в полости вирусных белков [1]. Однако, когда вирусные белки не имеют таких полостей, то к ним тяжело подобрать эффективный ингибитор. Напротив, антитела с высокой специфичностью и аффинностью можно получить для практически любого белкового антигена. Более того, это не обязательно должны быть природные антитела, но различные подобные антителам молекулы, обладающие помимо нужной специфичности и аффиности значительно меньшим, по сравнению с природными антителами, размером [2]. Для вируса SARS-CoV-2 потенциальной вирусной мишенью может быть нуклеокапсидный белок, или N-белок. Он связывается с вирусной РНК и принимает активное участие в сборке и упаковке вируса [3, 4], а также имеет целый ряд других важных для вируса функций, таких, например, как репликация и транскрипция вирусной РНК [5]. Учитывая, что гомология N-белков для вирусов SARS-CoV-2 и SARS-CoV составляет более 90% [6], антителоподобные молекулы, способные взаимодействовать с N-белком вируса SARS-CoV, теоретически могут взаимодействовать и с N-белком вируса SARS-CoV-2. Однако гомология не все определяет в данном вопросе и в каждом конкретном случае это предположение можно проверить только экспериментально. В данной работе мы использовали семь монободи (Fn-N) к N-белку вируса SARS-CoV, антителоподобных молекул, созданных на основе десятого домена фибронектина 3 типа человека [7]. Методом термофореза были определены константы диссоциации комплекса Fn-N и N-белка вируса SARS-CoV-2. Обнаружено, что высоким сродством к N-белку обладают только три из данных семи антителоподобных молекул.

Генно-инженерными методами были получены семь плазмид, каждая из которых содержала ген, кодирующий антителоподобную молекулу с His-тагом, а также плазмида, кодирующая N-белок SARS-CoV-2 с His-тагом (ShineGene). Далее, каждой из этих плазмид трансформировался штамм E. coli BL21(DE3). Индукцию экспрессии Fn–N и N-белка проводили 500 мкМ IPTG в течение 20 ч при 16°C для Fn–N и в течение 3 ч при 37°C для N-белка. Fn–N и N-белок выделяли из нерастворимой фракции [8], а затем очищали аффинной хроматографией на носителе Protino® Ni-TED Resin. Выделенные белки хранили в буфере 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 8.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле продемонстрировал достаточную степень чистоты полученных белков (98.9% для N-белка и 92.1%, 84.7%, 58.1%, 81.9%, 97.2%, 89.1%, 96.7% для Fn–N6, Fn–N10, Fn–N11, Fn–N15, Fn–N17, Fn–N20 и Fn–N22 соответственно). Белок Fn-N11 подвергается частичному гидролизу, что может сказаться на точности определения константы взаимодействия данной антителоподобной молекулы с N-белком.

Взаимодействие Fn-N с N-белком изучалось методом термофореза на приборе Monolith NT.115 Series (“NanoTemper Technologies GmbH”, Германия) в буфере 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, рН 7. Для предотвращения агрегации антителоподобных молекул в буфер добавляли 70 мМ имидазола. Чтобы исключить адсорбцию N-белка, на используемых в термофорезе капиллярах в буфер добавлялся 0.005–0.01% SDS. N-белок был помечен флуоресцентным красителем АТТО647. Для этого в 65 мМ карбонатном буфере (рН 8.5) к N-белку был добавлен полуторакратный мольный избыток активированного эфира красителя АТТО647 с дальнейшей инкубацией 1 ч при комнатной температуре и постоянном перемешивании. N-белок со связавшимся АТТО647 отделили от свободного красителя на хроматографической колонке PD10. Степень модификации N-белка красителем ATTO647 составила 0.76. Метод термофореза заключается в нагревании инфракрасным лазером части капилляра с образцом и измерения флуоресценции образца [9]. Уровень этой флуоресценции меняется в процессе образования комплекса между антителоподобной молекулой и N-белком.

При фиксированной концентрации N-ATTO647 (40 нМ) методом термофореза были получены зависимости относительной флуоресценции (за 100% принята флуоресценция до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации Fn–N (рис. 1). Для каждого эксперимента получали четыре таких зависимости, и весь эксперимент повторяли два-три раза. По каждой кривой определялась константа диссоциации комплекса Fn–N с N-белком, ее усредняли по всем 8–12 кривым и определяли относительную ошибку ее измерения. Для Fn–N10 не наблюдалось заметного связывания с N-белком (рис. 1а). А для Fn–N11, Fn–N17 и Fn–N22 (рис. 1а) константы диссоциации с N-белком составили 2.7 ± 0.6, 3.0 ± 0.5 и 2.9 ± 0.9 мкМ соответственно. Такие высокие константы диссоциации говорят о неспецифическом взаимодействии указанных монободи с N-белком. Высокоаффинное взаимодействие с N-белком наблюдалось для Fn–N6, Fn–N15 и Fn–N20 (рис. 1б). Для них константы диссоциации с N-белком составили 31 ± 7, 24 ± 4 и 66 ± 12 нМ соответственно.

Рис. 1.

Зависимости относительной флуоресценции (за 100% принята флуоресценция до начала термофореза) через 20 с после начала термофореза от концентрации Fn–N при постоянной концентрации N-белка (40 нМ) для Fn-N с низким сродством к N-белку (а) и с высоким сродством к N-белку (б). Указана среднеквадратичная ошибка определения относительной флуоресценции (8–12 повторов).

Таким образом, из семи антителоподобных молекул к N-белку вируса SARS-CoV только три взаимодействуют с высоким сродством с N-белком вируса SARS-CoV-2. Ранее в литературе, основываясь на высокой гомологии N-белка для этих двух вирусов, Du Y. et al. [10] предполагали, что Fn–N17 и Fn–N22 будут хорошо связываться и с N-белком вируса SARS-CoV-2. Однако полученные нами данные показывают, что это не так и для этих антителоподобных молекул наблюдается только низкоаффинное взаимодействие с N-белком вируса SARS-CoV-2 (рис. 1а). Наилучшим сродством к N-белку обладает антителоподобная молекула Fn–N15. Согласно литературным данным, она взаимодействует с С-концевым доменом N-белка [7]. Для ингибирования взаимодействия N-белка с РНК наибольший интерес представляет Fn–N20, взаимодействующая с N-концевым доменом N-белка [7]. Возможно, именно поэтому в работе 2009 г. для SARS-CoV из этих трех антителоподобных молекул Fn–N20 лучше всего ингибирует наработку как вирусной РНК, так и самих вирусных частиц [7].

В результате проведенной работы нами было продемонстрировано, что три из семи ранее описанных монободи, связывающихся с нуклеокапсидным белком вируса SARS-CoV, способны также взаимодействовать с N-белком вируса SARS-CoV-2. Данные антителоподобные молекулы могут послужить основой для разработки противовирусных препаратов, нацеленных как на SARS-CoV, так и на SARS-CoV-2.