Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 505, № 1, стр. 288-293

Сокращающаяся численность популяций и видового разнообразия земноводных нарушает устойчивость сообществ водных и наземных экосистем в различных регионах планеты [1–3]. На территории горного Урала в его естественных и антропогенных ландшафтах обитают экологически контрастные по температурной толерантности виды амфибий из отряда Anura – озерная лягушка (Pelophylax ridibundus Pallas, 1771) и из отряда Caudata – сибирский углозуб (Salamandrella keyserlingii Dybovsky, 1870) [4]. При исследовании механизмов гомеостаза сибирского углозуба и озерной лягушки нами показана видовая специфика термостабильного аминокислотного спектра плазмы крови изученных амфибий, поддерживающая их выживание и эврибионтность в широком температурном диапазоне [5]. Также отмечено присутствие в крови свободных аминокислот, обладающих иммуномодулирующими свойствами и участвующих в регуляции гемопоэза [5]. Известно, что в эволюционном аспекте роль системы крови позвоночных определяется как решающая при формировании резистентности организма к воздействию биотических и абиотических факторов среды (температура, гипоксия, токсичные химические вещества, паразитарные инфекции, стресс) [6–8]. Помимо этого, система крови у представителей герпетофауны достаточно высоко организована, а состав и морфология лимфоидной системы не отличаются от данных имеющихся научных источников по исследованию позвоночных [9–14]. Это позволяет считать, что адаптивная стратегия длительного пребывания сибирского углозуба (СУ) в условиях низко отрицательных температур (–30°С…–45°С) и толерантность озерной лягушки (ОЛ) к экстремально положительным температурам (+28°С…+40°С) несомненно обусловливает выживание амфибионтов [5, 15, 16]. Однако основная информация о механизмах иммунной защиты природных популяций хвостатых и бесхвостых амфибий весьма ограничена, а реакции адаптивного иммунитета и участие неспецифических иммунных ответов в регуляции физиологических процессов практически не исследованы [6].

Цель работы – сравнительный анализ иммуногематологических параметров периферической крови эктотермных амфибионтов природных популяций фауны Среднего Урала: сибирского углозуба (S. кeyserlingii) и озерной лягушки (P. ridibundиs).

Экспериментальные группы животных представлены половозрелыми самцами S. кeyserlingii (n = 20) и P. ridibundиs (n = 20), отловленными на территории Свердловской области (56°42′ с.ш. 61°20′ в.д.) в весенний (первая декада мая) и летний (последняя декада июля) сезоны 2019–2020 гг. Отлов амфибионтов в нерестовых водоемах проводился с помощью водного сачка; сбор особей СУ в летний период осуществляли вручную в наземных укрытиях. Животных без признаков заболеваний доставляли в лабораторию в отдельных контейнерах с влажным мхом в день отлова. Сибирский углозуб S. кeyserlingii включен в Красную Книгу Среднего Урала [17]. Статус – III категория. Редкий, малочисленный вид на периферии ареала. Встречается повсеместно, но спорадически. Экспериментальные особи СУ отловлены на затененных участках прибрежной части Калиновского пруда, расположенного в особо охраняемой лесопарковой зоне городской агломерации. Температура воды в весенний период составляла +11°С, в летний +17°С при среднесуточной температуре воздуха +15°С и +21°С соответственно. Взрослые особи СУ всю жизнь проводят на суше в прибрежной полосе нерестового водоема, за исключением короткого периода размножения. Длительного пребывания на солнце не переносят и при температуре в тени около +27°С погибают. Следует отметить, что большинство видов амфибий не способны адаптироваться к обитанию в теплых водоемах, тем не менее исследователи отмечают обитание озерной лягушки (инвазивный вид на Урале) в термальных водоемах, где температура воды достигает и до +30°С [4]. Опытные особи ОЛ отловлены в неглубоких заводях р. Тагил, где температура воды весной составляла в среднем +21°С, а летом +27°С и выше, при среднесуточной температуре воздуха +14°С и +19°С соответственно. Зимой температура воды исследуемого водотока не опускается ниже +10°С…+12°С, и обитающие в нем ОЛ характеризуются отсутствием зимней спячки. Показатели периферической крови определяли с помощью гематологического анализатора “BC-5800” (Mindray, Китай). Лейкоцитарную формулу рассчитывали на 100 лейкоцитов в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе. На основании лейкоцитарной формулы определяли интегральный лейкоцитарный индекс (ИСЛ – соотношение гранулоцитов и агранулоцитов в отн. ед.), позволяющий оценить модуляцию эффекторных механизмов иммунной системы и степень напряженности компенсаторных процессов в организме. Результаты обработаны с использованием пакета лицензионных прикладных программ “Statistica v. 10.0”. Метод главных компонент (PCA) реализован посредством статистической среды R (R 3.1.2, пакеты “Vegan и “Ade4”) [18].

Исследования периферической крови амфибионтов показали статистически значимое повышенное содержание гемоглобина в 1.5 раза у СУ (59.8 ± 3.3 г/л) в сравнении с ОЛ (40.2 ± 2.5 г/л) (р = 0.04). Показатели содержания гемоглобина соответствуют значениям, приведенным в работах отечественных исследователей [10, 14, 19]. Превышение содержания тромбоцитов в 3.5 раза (41.7 ± 5.8 Г/л) (р = 0.01) и двукратное повышение тромбокрита (РСТ = 0.02%) связаны с возросшей долей объема цельной крови, занимаемой тромбоцитами, участвующими в иммунных реакциях у ОЛ в сравнении с СУ. У сибирского углозуба в весенний и летний периоды отмечено высокое содержание лейкоцитов (77.0 ± 7.5 Г/л), что в 2.4 раза больше, чем у ОЛ (р = 0.001). Лейкоцитарный состав крови ОЛ и СУ, как и у всех позвоночных, представлен двумя группами клеток: гранулоцитами (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), определяющими реакции врожденного иммунитета, и агранулоцитами (моноциты, лимфоциты), ответственными за реакции адаптивного иммунного ответа [6, 20]. В весенний и летний периоды лейкоцитарная формула периферической крови исследуемых амфибий имеет лимфоидный профиль: у ОЛ (69.1–69.8%) и у СУ (52.4–56.7%) (табл. 1). Выявлены видовые различия по количественному содержанию лимфоцитов, гранулоцитов и агранулоцитов, отражающих взаимосвязь эффекторных механизмов иммунной системы генетически детерминированных видов амфибий (р < 0.001) (табл. 1).

Периферическая кровь исследованных видов характеризуется преобладанием агранулоцитов, обеспечивающих иммунный надзор и избирательную реактивность организма в весенний и летний сезоны: у ОЛ – 73.3–76.1% и у СУ – 55.7–60.3% (р < 0.001). Лимфоцитарно-гранулоцитарный состав периферической крови амфибий характеризуется невысокой долей гранулоцитов у ОЛ (24.0–26.7%) в сравнении с СУ (39.3–44.4%) (р < 0.001). В весенний и летний периоды в периферической крови СУ доля гранулоцитов в 1.7 раза выше, чем у ОЛ (p < 0.001), а доля агранулоцитов на 30% выше у ОЛ (табл. 1). Повышенный уровень нейтрофилов (р < 0.001) периферической крови СУ обеспечивает неспецифическую защиту организма как от токсических воздействий, так и от патогенных инфекций. Отмечена также разнонаправленность сезонной динамики палочкоядерных нейтрофилов в крови ОЛ и СУ (p < 0.001) (табл. 1). У летних особей ОЛ снижено содержание сегментоядерных нейтрофилов в 2.7 раза и у СУ в 3.3 раза.

Активация эозинофильного гранулоцитопоэза в крови самцов ОЛ в 2.6 раза (р < 0.001) и у СУ в 1.6 раза (р < 0.001) в летний период свидетельствует о единых механизмах, определяющих способность животных к избирательной адаптивной стратегии как по антимикробной, так и по противогельминтной иммунной защите [13, 14]. В периферической крови половозрелых самцов СУ в весенний и летний периоды отмечено значимое содержание участников клеточных воспалительных реакций: базофильных лейкоцитов (0.08–0.09%) и их отсутствие в крови ОЛ. Межвидовые различия по содержанию моноцитов у исследуемых гидробионтов весной отсутствуют (р = 0.15) и наблюдаются в летний период (р < 0.001). Известно, что повышенная активация моноцитов, выполняя фагоцитарную роль, продуцирует провоспалительные цитокины – эндогенные регуляторы гемопоэза и клеточно-опосредованного иммунного ответа [7, 11, 20].

По-видимому, в ответ на действие эндотоксинов среды обитания моноциты ОЛ (в отличие от СУ) в летний период усиливают выработку провоспалительных цитокинов, активируя систему естественного иммунитета (p < 0.001). Проведенный расчет ИСЛ подтвердил межвидовые различия в лейкоцитарном профиле исследованных животных. Высокий показатель ИСЛ (0.65–0.80) для СУ, по сравнению с ИСЛ (0.32–0.36) для ОЛ подтверждает более выраженную реактивность системы врожденного иммунитета, обеспечивающей неспецифическую срочную защиту организма от патогенных антигенов среды обитания (p < 0.001). Наряду с едиными закономерностями, выявленными в путях поддержания гомеостаза у двух видов амфибий: озерной лягушки и сибирского углозуба, показана и определенная стратегия разнонаправленности в механизмах аварийного регулирования иммунитета.

Использование метода главных компонент (РСА) позволило визуализировать видовую и сезонную специфику лейкоцитарного состава крови СУ и ОЛ, подтверждая результаты представленного выше статистического анализа. Показано, что 46.93% общей дисперсии параметров крови приходится на первую главную компоненту (РС1), 31.92% – на вторую главную компоненту (РС2) (рис. 1). Первая (РС1) и вторая (РС2) главные переменные обусловливают значимые различия амфибионтов по основным параметрам лейкоцитарной крови. Наибольший вклад в межвидовую изменчивость показателей крови по РС1 вносят лимфоциты (30.43%), моноциты (25.01%), палочкоядерные нейтрофилы (17.68%), сегментоядерные нейтрофилы (16.52%). Их коэффициенты корреляции с РС1 составили соответственно: 0.93, 0.84, –0.71, –0.68 (р < 0.001). Первая главная компонента по этим переменным четко выделяет в самостоятельные группы как особей резистентного вида к холоду (СУ), так и теплоустойчивого вида (ОЛ) (рис. 1). Со второй главной компонентой РС2 высоко коррелируют эозинофилы (0.80), юные нейтрофилы (0.81), сегментоядерные нейтрофилы (–0.62). Вклад этих показателей в сезонную изменчивость лейкоцитарной формулы изучаемых видов амфибий составил 33.67, 34.18 и 20.29%, соответственно, что также подтверждает неоднородность особей исследованных двух экологически контрастных видов амфибий по данным показателям. Из рисунка видно, что все представленные данные обособлены в четыре самостоятельные группы, причем их наибольшая пространственная дифференциация обусловлена альтерацией лейкоцитарного состава крови в зависимости от сезона.

Рис. 1.

Результаты компонентного анализа лейкограммы (%) сибирского углозуба (СУ) и озерной лягушки (ОЛ) в разные сезоны года. PC1, PC2 – оси главных компонент, % – процент дисперсии данных, объясненных главной компонентой; стрелки отражают корреляцию главных компонент с исходными показателями; эллипсы представляют собой 95% доверительные области.

Таким образом, результаты проведенных исследований впервые позволили оценить видовую специфику эффекторных механизмов иммунной системы в регуляции физиологических процессов амфибионтов: озерной лягушки и сибирского углозуба, что обеспечивает выживание и эврибионтность исследованных видов в широком температурном диапазоне естественных и антропогенных ландшафтов Среднего Урала. Знание о наследственно обусловленных иммуногематологических параметрах гомеостаза видов, помимо несомненного теоретического интереса, имеют и прикладное значение при разработке природоохранных мероприятий в условиях быстрых преобразований среды обитания.