Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 505, № 1, стр. 322-328

Одним из важнейших свойств живого организма является поддержание оптимального кислотно-щелочного равновесия и ионного состава внутренней среды, необходимого для жизнедеятельности клеток в условиях влияния внешних и внутренних факторов. Почки и легкие являются основными органами, регулирующими pH в организме [1]. Почки регулируют кислотно-щелочное равновесие, увеличивая или снижая концентрацию ионов HCO₃^– и H+ в жидкостях организма. Ключевую роль в этих процессах играют вставочные клетки собирательных трубочек почки. Так, α-вставочные клетки секретируют в мочу избыток кислоты и реабсорбируют бикарбонат в кровь, β-вставочные клетки секретируют бикарбонат и реабсорбируют кислоту.

Изучение регуляции кислотно-щелочного равновесия в организме привело к открытию pH-чувствительных молекул, свойства и активность которых регулируется при изменении pH среды. Одним из сенсоров щелочного рН является рецептор, подобный рецептору инсулина (IRR), член семейства рецептора инсулина, которое также включает рецептор инсулина (IR) и рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR) [2]. В отличие от своих близких гомологов рецепторов IR и IGF-IR, которые экспрессируются в широком спектре тканей и клеток, экспрессия IRR специфична, рецептор обнаруживается в некоторых органах, в определенных типах клеток. В почке IRR экспрессируется в β-вставочных клетках собирательных трубочек. У мышей с нокаутом по гену insrr, кодирующему рецептор IRR, в условиях щелочной нагрузки наблюдается нарушение секреции бикарбоната, а именно вывод его с мочой, что свидетельствует о роли рецепторной тирозинкиназы IRR в регуляции кислотно-щелочного равновесия в организме [3]. Также есть данные о том, что IRR экспрессируется в сердце и вместе с гомологами обеспечивает систему для стимуляции синтеза белка, обладает кардиопротекторными свойствами [4]. На данный момент молекулярные механизмы, лежащие в основе функционирования рецептора IRR, не известны. С целью поиска белков, функционально связанных с рецепторной тирозинкиназой IRR, нами было проведено широкомасштабное секвенирование транскриптома почек мышей дикого типа и нокаутных по гену insrr, которых содержали в нормальных условиях и в условиях щелочной нагрузки. Данные РНК-секвенирования подтверждали методами TaqMan ПЦР в реальном времени и Вестерн блоттингом.

Мыши с нокаутом гена insrr-/- были получены ранее на основе линии мышей C57Bl/6J. Для минимизации эффекта накопления мутаций был использован метод разведения мышей литтермейтсов, потомков одного поколения гетерозигот. В экспериментах использовали самок мышей дикого типа и нокаутных по гену insrr-/- одного возраста, 3–4 мес. Животных обоих генотипов (по 4 животных в каждой группе) содержали в двух условиях. При нормальных условиях мышей поили водой. В условиях щелочной нагрузки в течение 7 дней в воду для питья добавляли 280 мМ бикарбоната натрия. Показано, что при данных условиях у мышей или крыс развивается легкий метаболический алкалоз [5–7]. Для выравнивания метаболического статуса животных за 12 ч до извлечения органов у мышей забирали пищу, но оставляли питье. Перед выделением органов животных усыпляли с помощью анестезирующих препаратов, золетил 20 мг/кг массы тела, ксилазин 5 мг/кг массы тела в 0.9% растворе NaCl. Затем мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации. Эксперименты с животными проводили в соответствии с протоколом комитета по уходу и использованию животных (IACUC, Institutional Animal Care and Use Committee), утвержденным Комиссией по биоэтике Института биоорганической химии им. Шемякина–Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

Был проведен сравнительный анализ транскриптомов почек однопометных мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена insrr, который кодирует рецепторную тирозинкиназу IRR, методом глубокого РНК-секвенирования. Для РНК-секвенирования вырезали сегмент почки толщиной 3 мм из серединного отдела, помещали в буфер RNAlater и передавали для дальнейшего исследования в ЗАО “Геноаналитика” (Россия, Москва). Секвенирование проводили на приборе Illumina HiSeq 2500. Считывания RNA-Seq были сопоставлены с эталонным геномом мыши (mm10) с помощью STAR. Для количественной оценки уровней экспрессии всех аннотированных генов использовались считывания с уникальным картированием (Ensembl v.92). Количество общих генов было нормализовано до CPM (количество на миллион) с помощью EdgeR. Анализ дифференциальной экспрессии также выполняли с использованием EdgeR. Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программного обеспечения Prism 8 (GraphPad Software, USA). Данные, полученные для животных двух генотипов, соответствовали критерию нормальной выборки (критерий Шапиро–Уилка). Поэтому для расчета статистической значимости двух выборок использовали t-критерий Стьюдента, результаты считали статистически значимыми при p < 0.05.

В результате транскриптом содержал 13 430 генов, из которых при нокауте гена insrr в нормальных условиях достоверно изменяют свою дифференциальную экспрессию 2316 генов, из них 1348 генов с увеличенной экспрессией, 968 – с уменьшенной экспрессией. В условиях щелочной нагрузки достоверно изменили дифференциальную экспрессию 2879 генов, из них 1504 генов с увеличенной экспрессией и 1375 генов с пониженной экспрессией у мышей, нокаутных по insrr. Полученные данные были проанализированы с помощью базы данных PANTHER (pantherdb.org) для получения сведений о биологических процессах и сигнальных путях, в которые вовлечены гены с измененной экспрессией при нокауте гена insrr. Выявлены гены, связанные с сигнальным путем рецептора гонадолиберина, рецептора холецистокинина, а также гены цитокинов и белков клеточной адгезии. Гонадолиберин стимулирует развитие преимплантационных эмбрионов мыши, что представляет большой интерес, так как ранее нами было показано влияние рецепторной тирозинкиназы IRR на развитие преимплантационных эмбрионов мыши [8]. Среди биологических процессов обнаружены изменения экспрессии генов, участвующих в организации клеточных компонентов, генов-регуляторов, которые кодируют ДНК- и РНК-связывающие белки, факторы транскрипции и др. Выделили 1138 генов, вовлеченных в метаболические процессы клетки, среди которых множество генов, участвующих в синтезе метаболитов и связанных с энергетическими процессами в клетке.

По данным, полученным в результате РНК-секвенирования, мы наблюдали значительное снижение экспрессии гена gapdh в почках мышей, нокаутных по гену insrr (рис. 1а).

Рис. 1.

а – Данные РНК-секвенирования почек мышей для гена gapdh (количество животных в каждой группе n = 4); б – результаты ПЦР в реальном времени для образцов кДНК из почек мыши для гена gapdh (*p < 0.05). Отрезками отмечены значения среднеквадратической ошибки (SEM). WT – мыши дикого типа, КО – мыши, нокаутные по гену insrr.

Ген gapdh часто используется в качестве референсного гена при проведении ПЦР в реальном времени. Однако достоверная разница экспрессии gapdh в двух генотипах при разных условиях не позволяет использовать этот ген в качестве референсного при проведении ПЦР в реальном времени в случае мышей, нокаутных по гену insrr. При поиске референсных генов для ПЦР в реальном времени, с помощью литературных данных [9], были подобраны два гена, экспрессия которых по данным РНК-секвенирования не изменялась у животных разного генотипа при различных условиях – Ap3d1 и Csnk2a2. Ap3d1 – ген, кодирующий субъединицу адаптерного белка, участвующего в транспорте везикул в аппарате Гольджи. Csnk2a2 – ген, кодирующий каталитическую субъединицу конститутивно активной серин/треонин-протеинкиназы. В ходе экспериментов были получены образцы РНК из почек мышей, которую использовали для синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы. Полученную кДНК использовали как матрицу для ПЦР в реальном времени. Для каждого гена были подобраны специфичные праймеры и зонд с флуоресцентной меткой (см. табл. 1), синтезированные компаниями Lumiprobe и ЕвроГен (Москва, Россия), содержащие флуорофор FAM и тушитель BHQ1. Для дизайна праймеров использовали программы GeneRunner, OligoExplorer, OligoAnalyzer. Ген Ap3d1 показал более высокий и стабильный уровень экспрессии и был выбран основным референсным геном для подсчета данных ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили на приборе DTprime фирмы ДНК-технология (Россия, Москва), для каждого образца кДНК в трех повторах. Нормализованную относительно референсного гена экспрессию рассчитывали по протоколу, описанному в [10].

По данным ПЦР в реальном времени экспрессия гена gapdh в почке мыши снижается на 54% (p < 0.05) при нокауте гена insrr (рис. 1б). В условиях щелочной нагрузки у нокаутных по insrr мышей также наблюдалось снижение на 59% уровня экспрессии gapdh по сравнению с мышами дикого типа (p < 0.05). При этом в двух условиях уровни экспрессии гена gapdh оставались примерно одинаковыми и для животных дикого типа, и для нокаутных по insrr. Таким образом, можно предположить, что изменение экспрессии гена gapdh не связано с условиями экспериментального алкалоза.

Помимо анализа экспрессии мРНК, мы провели анализ экспрессии GAPDH на белковом уровне методом Вестерн блоттинга на образцах тотальных лизатов почек мышей дикого типа и нокаутных по гену insrr, содержащихся в нормальных условиях и в условиях щелочной нагрузки. В каждой группе было по 4 животных. Для получения белковых лизатов из животных извлекали почки, гомогенизировали в бездетергентном буфере на керамических шариках Lysing matrix D (MP Biomedicals) с использованием классической настольной системы для лизиса FastPrep-24 (MP Biomedicals), содержащем Tris-HCl 100 мМ, коктейль ингибиторов протеаз (Sigma Aldrich), PMSF 1 мМ. Затем добавляли додецилсульфат натрия (SDS) до конечной концентрации 2%. Концентрацию белка определяли реагентом Coomassie Protein Assay kit (Sigma Aldrich) согласно протоколу производителя.

Белковые лизаты анализировали методом вестерн блоттинга с антителами anti-GAPDH 1:1000 (SC #25778), anti-β-actin 1:5000 (Cell Signaling #3700). Для количественного анализа вестерн блоттинга использовали программу Fusion Solo (Vilber Lourmat). Сигналы на блотах анализировали денситометрией. В качестве контрольного белка использовали β-актин, экспрессия которого не меняется в почках мышей обоих генотипов в двух условиях по данным РНК-секвенирования. Определено отношение сигнала GAPDH к актину в каждом из образцов белковых лизатов почки. Отношение плотности сигнала пересчитали в процентах, где за 100% приняли среднее значение сигнала в лизатах почки животных дикого типа в нормальных условиях. По данным вестерн блоттинга (см. рис. 2) было выявлено снижение количества белка GAPDH в почках животных, нокаутных по гену insrr как при нормальных условиях (на 19%), так и в условиях щелочной нагрузки (на 39%, p < 0.05).

Рис. 2.

а – Вестерн-блот анализ тотальных лизатов почек мышей. Слева указано положение белковых маркеров в геле, кДа, сверху указаны антитела, которыми производили окраску; б – количественный анализ экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (количество животных в каждой группе n = 4, *p < 0.05). Отрезками отмечены значения среднеквадратической ошибки (SEM). WT – мыши дикого типа, КО – мыши, нокаутные по гену insrr.

Ген gapdh, который относится к генам “домашнего хозяйства”, кодирует фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH). Эти гены являются конститутивными генами, которые необходимы для поддержания основных клеточных функций и стабильно экспрессируются во всех клетках организма при любых условиях и на всех стадиях развития [11]. Однако ранее были показаны различия в уровнях экспрессии мРНК gapdh между разными тканями. Ген gapdh экспрессируется во всех органах, наибольшее количество мРНК обнаруживается в тканях с активным энергопотреблением, в скелетных и сердечной мышцах [12]. Уровень экспрессии мРНК GAPDH может меняться с возрастом и статусом питания, что было показано на модели цыплят на ранних сроках после вылупления [13]. Так же есть сведения, что уровень мРНК гена gapdh примерно одинаков для тканей почки, печени и мозга [14]. Далее мы провели исследования образцов кДНК из печени и мозга мыши методом TaqMan ПЦР в реальном времени, чтобы понять, характерно ли снижение экспрессии гена gapdh, наблюдаемое в почках, для других органов. Результаты показаны на рис. 3, где видно, что снижение экспрессии гена gapdh у нокаутных по insrr животных характерно также для печени (рис. 3а) и мозга (рис. 3б), все изменения достоверны (p < 0.01). Для печени и мозга показано снижение экспрессии гена gapdh на 30.5 и 13.7% соответственно.

Рис. 3.

а – Результаты ПЦР в реальном времени для образцов кДНК из печени мыши для гена gapdh, б – результаты ПЦР в реальном времени для образцов кДНК из печени мыши для гена gapdh (количество животных в каждой группе n = 4, *p < 0.05). Отрезками отмечены значения среднеквадратической ошибки (SEM). WT – мыши дикого типа, КО – мыши, нокаутные по гену insrr.

GAPDH хорошо известен как один из ключевых ферментов, участвующих в гликолизе. Помимо своей роли в гликолизе GAPDH участвует во множестве внутриклеточных процессов, таких как апоптоз, транспорт железа, слияние мембран, регуляция транскрипции, транспорт везикул от эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи, а также клеточная реакции на воздействия окружающей среды, например, при окислительном стрессе или гипоксии [15]. В почке млекопитающих показано, что GAPDH связан с хлоридно-бикарбонатным обменником AE1 (slc4a1), который отвечает за реабсорбцию бикарбоната в α-вставочных клетках собирательной трубочки. Α-вставочные клетки почек отвечают за выведение избытка кислот из организма и реабсорбцию бикарбоната в кровь, участвуя таким образом в поддержании кислотно-основного гомеостаза. Для C-конца белка AE1 в почке характерно связывание с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, которое обеспечивает его локализацию на мембране [16]. Исходя из этого, можно предположить участие GAPDH в регуляции кислотно-основного баланса в почке.

Показано, что GAPDH участвует во многих событиях, которые связаны с общим процессом передачи сигналов инсулина, включая сигнальные пути белков PI3K, Akt, Rab [14]. Интересно, что взаимодействие между GAPDH (т.е. фосфорилированной формой фермента) и фосфорилированным Akt в сердечной мышце крыс возникает при повышении глюкозы в крови [17]. Рецепторы инсулинового семейства, в том числе и IRR, так же задействуют сигнальные пути, связанные с PI3K и Akt белками. Снижение уровня экспрессии белка GAPDH может приводить к изменению уровня метаболизма у мышей, нокаутных по гену insrr, о чем свидетельствуют и наши предыдущие исследования [18]. Ранее мы показали, что у мышей, несущих нокаут insrr -/-, наблюдаются поведенческие особенности в виде снижения агрессивно-оборонительного поведения [19], что может быть связано с изменением экспрессии ряда генов, в том числе gapdh в мозге нокаутных мышей.

Ген gapdh используется в качестве гена сравнения для ПЦР в реальном времени в большинстве современных исследований. Полученные в ходе наших экспериментов данные не позволяют использовать этот ген как референсный для анализа экспрессии генов мышей, нокаутных по insrr. Для животной модели, используемой в эксперименте, нами был выбран ген Ap3d1 в качестве референсного. В данной работе мы показали снижение экспрессии гена gapdh в почках мышей, нокаутных по insrr, методами РНК-секвенирования, TaqMan ПЦР в реальном времени и Вестерн блоттинга, как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Методом TaqMan ПЦР в реальном времени мы выявили также снижение уровня экспрессии gapdh не только в почках, но и в печени и мозге мышей, нокаутных по insrr. Ранее нами было показано, что у мышей, нокаутных по гену insrr, при щелочной нагрузке на организм наблюдается пониженная секреция бикарбоната в мочу [20]. При этом нокаут гена insrr приводит к снижению экспрессии Cl^–/HCO₃^–обменника SLC26A4, который локализуется в β-вставочных клетках почечных канальцев, участвующих в секреции ионов бикарбоната почками. Таким образом, изменение экспрессии гена gapdh в почках мышей, нокаутных по insrr, может свидетельствовать о функциональной взаимосвязи генов, и о возможной роли GAPDH в ранее не описанных молекулярных механизмах регуляции кислотно-основного баланса в организме.