Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 506, № 1, стр. 338-342

В 1996 г. в нашем институте был описан ген нового белка Tag7 (также известного как пептидогликан-распознающий белок 1 PGLYRP1 или PGRP-S) [1]. Он принадлежит к консервативному семейству белков, обнаруженных у различных организмов от насекомых до млекопитающих. Данные белки распознают уникальный компонент клеточной стенки бактерий – пептидогликан [2]. Было показано, что у насекомых Tag7 участвует в антибактериальной защите организма посредством активации Toll-рецепторов [3]. У млекопитающих данный белок является компонентом врожденного иммунитета, участвует в фагоцитозе нейтрофилов [4], а также в комплексе с белком теплового шока Hsp70 активирует Т-лимфоциты и играет важную роль в противоопухолевой защите [5].

Помимо Hsp70, Tag7 способен связываться с Ca²⁺-связывающим белком метастазином-1 (Mts1 или S100A4). Наиболее изученной функцией Mts1 является участие в метастазировании опухолевых клеток [6], однако, он экспрессируется и в нормальных клетках организма, включая фибробласты, лимфоциты и макрофаги. В нашей лаборатории было показано, что комплекс Tag7-Mts1 способен вызывать направленную миграцию лимфоцитов человека по градиенту концентрации (хемотаксис) [7]. Этот процесс играет важную роль в развитии иммунного ответа, воспалительных реакций, а также в патогенезе инфекционных и онкологических заболеваний.

Одной из субпопуляций лимфоцитов, осуществляющих координацию иммунного ответа, являются регуляторные Т-клетки (Treg). Основная их функция заключается в подавлении аутоиммунных реакций. Нарушение баланса созревания и активации этих клеток лежит в основе патогенеза таких болезней, как ревматоидный артрит, псориаз и системная красная волчанка [8]. Впервые регуляторные T-клетки были описаны как лимфоциты с фенотипом CD4⁺CD25⁺, подавляющие развитие аутоиммунных заболеваний у мышей [9]. Позже было обнаружено, что для нормального созревания и функционирования Т-регуляторным лимфоцитам необходим транскрипционный фактор FoxP3. Он обеспечивает их супрессивные свойства, стимулируя экспрессию генов IL2Ra, CTLA4 и TNFRsf18. Также FoxP3 подавляет экспрессию эффекторных цитокинов, в т.ч. IL4, IFNg, и активность циклической нуклеотидной фосфодиэстеразы 3B (PDE3B), поддерживая необходимый гомеостаз в Т-регуляторных клетках [10]. Однако в экспериментах по идентификации и сортировке Тreg оказалось, что среди FoxP3⁺ клеток встречаются также лимфоциты с фенотипом CD4⁺CD25^–. Поиск более специфичных маркеров для регуляторных Т-лимфоцитов привел к открытию обратной корреляции между экспрессией FoxP3 и рецептора IL7 (CD127). Было показано, что более 85% клеток с фенотипом CD4⁺CD25⁺CD127^–(Lo) экспрессируют FoxP3 [11]. При проверке супрессивных свойств клетки CD4⁺CD25⁺CD127^– продемонстрировали свою высокую эффективность [12]. Таким образом, использование указанных трех маркеров позволяет с точностью более 85% идентифицировать регуляторные Т-лимфоциты в периферической крови методом проточной цитофлуориметрии. Изучение свойств Тreg клеток представляет большой интерес в свете новых данных об их участии в противоопухолевом иммунном ответе, заживлении ран, аллергии на пищу и других процессах организма.

Целью данной работы было исследовать способность регуляторных Т-клеток к хемотаксису по градиенту концентрации комплекса Tag7-Mts1, а также выяснить, выделяют ли они данный комплекс в среду инкубации.

Лимфоциты получали из лейкомассы здоровых доноров путем центрифугирования на градиенте фиколла по стандартной методике. Все доноры подписывали добровольное согласие, материал был принят в работу анонимно. CD4⁺ (рис. 1) и CD4⁺CD25⁺ (рис. 2) субпопуляции лимфоцитов выделяли с использованием наборов с магнитными шариками Dynabeads (Invitrogen, США). Хемотаксис проводили в камерах HTS Transwell (96 лунок, полиэфирная мембрана, поры 8 мкм, производство Corning, США) в среде RPMI без сыворотки при 37°С, 5% CO₂ и 95% влажности. В качестве хемоаттрактантов использовали комплекс Tag7-Mts1 в концентрации 10^–7 М и CCL5 (R&D Systems, США) в концентрации 5 × 10^–9 М. Для образования комплекса Tag7 смешивали с Mts1 в соотношении 1:2 и инкубировали 1 ч. В качестве отрицательного контроля использовали среду RPMI без сыворотки. Через 18 ч после нанесения в хемотактическую камеру подсчитывали количество клеток, оказавшихся в нижней ячейке, с использованием набора МТТ (Abcam, Великобритания), а фенотип мигрировавших клеток определяли на проточном цитофлуориметре Cytoflex (Beckman Coulter Life Sciences, США). Для проточной цитофлуориметрии были использованы следующие антитела: антитела к CD8 и CD4 производства Invitrogen, США, антитела к CD25 производства Biolegend, США, антитела к CD127 производства Beckman Coulter, США. В эксперименте с кондиционированной средой (рис. 3) ингибиторные антитела к Tag7 (Invitrogen, США) и Mts1 (ThermoScientific, США) добавляли в нижнюю ячейку хемотактической камеры за час до начала инкубации общей лимфоцитарной фракции с супернатантами. Долю мигрировавших клеток для каждой из субпопуляций рассчитывали как (общее количество клеток в нижней камере × процент данной популяции по данным цитофлуориметрии) / (общее количество клеток, нанесенных в верхнюю камеру × процент данной популяции в исходной смеси клеток по данным цитофлуориметрии) × 100%. На рисунках представлены данные не менее трех независимых экспериментов как среднее ± стандартное отклонение. Для статистической обработки использовали пакет SigmaPlot (Systat Software Inc, Великобритания).

Рис. 1.

CD4⁺ и СD8⁺ лимфоциты способны мигрировать по градиенту концентрации комплекса Tag7-Mts1 и CCL5.

Рис. 2.

CD127^– Т-регуляторные лимфоциты более активно мигрируют в ответ на градиент концентрации комплекса Tag7-Mts1, чем субпопуляция CD127⁺.

Рис. 3.

Tag7 и Mts1 не играют роль хемоаттрактантов в Treg-индуцированном хемотаксисе.

На первом этапе работы мы проанализировали способность CD4⁺CD25⁺ Т-лимфоцитов к миграции по градиенту концентрации хемоаттрактивных веществ. Для этого мы провели хемотаксис общей фракции лимфоцитов и определили фенотип мигрировавших клеток с помощью проточного цитофлуориметра. Ранее в нашей лаборатории уже было показано, что комплекс Tag7-Mts1 вызывает миграцию лимфоцитов [7]. В данной работе мы в качестве хемоаттрактантов использовали как комплекс Tag7-Mts1, так и классический хемокин CCL5 в качестве положительного контроля (рис. 3). Оба использованных нами хемотактических агента индуцировали клеточную миграцию.

Было обнаружено, что значительная часть CD8⁺ клеток активно отвечала на хемоаттрактанты. Как субпопуляция CD4⁺, так и CD4⁺CD25⁺ активированные клетки также мигрировали в присутствии хемоаттрактантов интенсивнее, чем без них. Причем мы наблюдали миграцию клеток CD4⁺CD25⁺ и в ответ на CCL5, и в ответ на комплекс Tag7-Mts1.

Для более точной идентификации Т-регуляторных лимфоцитов мы проанализировали негативный профиль экспрессии маркера CD127. Для этого мы предварительно выделяли фракцию CD4⁺ клеток с помощью магнитных шариков Dynabeads, затем наносили эти клетки в камеру Transwell и мигрировавшие клетки исследовали на проточном цитофлуориметре (рис. 2). Мы обнаружили существенную разницу в миграции клеток, экспрессирующих маркер CD127, и без него. Клетки с фенотипом CD4⁺CD25⁺CD127^–, которые и считаются регуляторными Treg лимфоцитами, были значительно более активны в ответ на градиент концентрации комплекса Tag7 и Mts1, чем клетки CD127⁺. Таким образом, было показано, что регуляторные лимфоциты способны к хемотактическому движению под действием Tag7-Mts1 комплекса.

Хорошо известно, что одной из важнейших функций CD4⁺ клеток является выработка различных веществ, воздействующих на другие клетки иммунной системы. Для того чтобы выяснить, вырабатывают ли регуляторные T-лимфоциты хемоаттрактанты, и, в частности, комплекс Tag7-Mts1, мы провели эксперимент с супернатантами. Была подготовлена среда, кондиционированная CD4⁺CD25⁺ клетками (как описано в [7]), и добавлена в нижнюю ячейку хемотактической камеры. В верхнюю ячейку поместили общую лейкоцитарную фракцию. Важно отметить, что никакой предварительной активации клеток проведено не было. В качестве положительного контроля была использована среда – супернатант от общей фракции мононуклеарных клеток (рис. 3). Среда, кондиционированная как общей лейкоцитарной, так и CD4⁺CD25⁺ фракцией, вызывала миграцию значительного количества лимфоцитов.

При добавлении к супернатантам ингибирующих антител к Tag7 и Mts1 активность миграции лимфоцитов снижалась в ячейках, где в качестве стимулятора выступал супернатант от общей фракции лимфоцитов, а в случае супернатанта от клеток CD4⁺CD25⁺ никаких изменений мы не обнаружили. Полученные в данном эксперименте результаты указывают на то, что CD4⁺CD25⁺Т-клетки способны вызывать хемотаксис, однако, Tag7 и Mts1 в этом процессе не участвуют. Ранее в нашей лаборатории было показано, что в среде, кондиционированной общей лейкоцитарной фракцией, присутствует комплекс Tag7-Mts1 [7]. Можно предположить, что основной вклад в экспрессию данного комплекса вносят клетки CD8⁺, а Т-регуляторные клетки, по всей видимости, его в среду инкубации не выделяют.

Комплекс Tag7-Mts1 занимает особое место среди хемоаттрактантов. Он не имеет специфической для классических хемокинов третичной структуры (“греческого ключа”), однако, несмотря на это, способен активировать движение лимфоцитов. Ранее мы показали, что данный комплекс способен вызывать миграцию NK и Т-клеток. Моноциты и нейтрофилы в ответ на градиент концентрации данного комплекса не проявили способности к движению [7]. В данной работе мы обнаружили, что регуляторные T-лимфоциты с фенотипом CD4⁺CD25⁺CD127^– способны к хемотактическому движению по градиенту концентрации комплекса Tag7-Mts1. При этом, по всей видимости, сами регуляторные T-лимфоциты данный комплекс не экспрессируют, а вырабатывают другие молекулы с хемоаттрактивными свойствами.