1. На главную
  2. Электронные версии
  3. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни
  4. T. 506, № 1, 2022

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 506, № 1, стр. 417-421

РОЛЬ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЛИКОДЕЛИНА В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ Т-ЛИМФОЦИТОВ

К. Ю. Шардина 1, В. П. Тимганова 1, М. С. Бочкова 1, 2, П. В. Храмцов 1, 2, М. Б. Раев 1, 2, С. А. Заморина 1, 2, *

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук – филиал ПФИЦ УрО РАН
г. Пермь, Россия

2 Пермский государственный национальный исследовательский университет
г. Пермь, Россия

* E-mail: zamorina.sa@gmail.com

Поступила в редакцию 22.04.2022
После доработки 25.05.2022
Принята к публикации 27.05.2022

Полный текст (PDF)

Аннотация

Исследовали влияние рекомбинантного гликоделина (GdA) на уровень Т-регуляторных лимфоцитов (Treg) в культуре активированных CD4+-лимфоцитов, одновременно оценивая пролиферативный статус клеток. В исследовании применяли рекомбинантный GdA, полученный из E. coli и из клеток HEK293 в концентрациях 0.2, 2 и 10 мкг/мл. Установлено, что только низкая концентрация (0.2 мкг/мл) рекомбинантного GdA бактериального происхождения снижала количество пролиферирующих CD4+-лимфоцитов, а также количество Treg (CD4+CD25highCD127–/low) в экспериментальной системе.

Ключевые слова: беременность, гликоделин, дифференцировка клеток, регуляторные T-лимфоциты

Гликоделин (PP14, PAEP, альфа-2-микроглобулин) – это димерный гликопротеин с молекулярной массой 42–56 кД, который был впервые выделен и идентифицирован в 1976 г. как новый антиген плаценты [1]. Известно, что амниотический вариант гликоделина (GdA) секретируется преимущественно децидуальным железистым эпителием под влиянием прогестерона, накапливаясь в амниотической жидкости и материнской сыворотке во время беременности [2]. Невзирая на то что иммунодепрессивные эффекты гликоделина хорошо известны [3, 4], его роль в формировании иммунной толерантности в период беременности остается неизученной.

С точки зрения формирования толерантности при беременности, одной из ключевых является субпопуляция регуляторных T-лимфоцитов (Treg). Дефицит этих клеток или их функциональная недостаточность связаны с осложнением или прерыванием беременности, а повышение уровня Treg ассоциировано с успешным течением беременности [5].

Известно, что GdA способен повышать уровень антигенспецифичных Treg в присутствии антигенпрезентирующих клеток [6], однако прямые эффекты этого белка на дифференцировку Т-клеток практически не изучены. Нативный и рекомбинантный GdA способны напрямую регулировать дифференцировку наивных Т-хелперов, способствуя доминированию Th2 над Th1 [8]. Реализацию эффектов GdA на уровне Т-клеток связывают с вовлечением мембранной молекулы СD45 [7].

Таким образом, целью данной работы являлось изучение роли рекомбинантного GdA в регуляции дифференцировки Treg в модели in vitro. В рамках поставленной цели решались две задачи – изучение влияния двух различных по гликозилированию форм рекомбинантного гликоделина, а также изучение пролиферативного статуса клеток в эксперименте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводилось согласно Хельсинкской Декларации ВМА 2000 г. и протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г., получено разрешение этического комитета ИЭГМ УрО РАН (IRB00010009) от 1.03.2022.

Объекты исследования. Образцы венозной крови были взяты у здоровых доноров (небеременные женщины, n = 5, возраст 25–39 лет) путем венопункции. Мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) выделяли центрифугированием в градиенте плотности диаколл-верографина (Diacoll 1077, “Dia-M”, Россия, ρ = =  1.077  г/см3).  Монокультуры  CD4+-клеток (Т-хелперы) получали методом иммуномагнитной сепарации с использованием магнитных частиц MACS® MicroBeads (“Miltenyi Biotec”, Германия). Чистота выделения Т-хелперов составила 96.7 ± 1.7%.

В работе использовали два вида рекомбинантного гликоделина: GdA [продуцент E. coli, 22.4 кДа] и mGdA [продуцент HEK-239м, 23.9 кДа], (“MyBioSource. Inc.”, США) в концентрациях 0.2 и 2 мкг/мл, соответствующих его уровню в периферической крови женщины при физиологической беременности (0.2 мкг/мл – I и III триместры; 2 мкг/мл – II триместр), а также 10 мкг/мл, соответствующей его концентрации в амниотической жидкости (I триместр) и тканях эндометрия [9]. В препаратах гликоделина оценивали концентрацию эндотоксина (ЛПС) с помощью ЛАЛ-теста (“Thermo Scientific”, США). Концентрация эндотоксина в препаратах гликоделина была >0.5 ЕU/мл, поэтому в среду культивирования клеток добавляли полимиксин В (Sigma, США) для подавления действия ЛПС. Полученные монокультуры Т-хелперов в концентрации 1 × 106 клеток инкубировали в 96-луночном планшете в полной питательной среде (RPMI-1640 (Sigma Aldrich, США), 10% FBS (“BI”, Израиль), 10 мМ Hepes (“ICN Рh.”, США), 2 мМ L-глутамина (“ICN Рh.”, США), 100 мкг/мл пенициллина-стрептомицина-амфотерицина (“BI”, Израиль)) и 30 мкг/мл полимиксина В с активационными частицами (#130-091-441, “Miltenyi Biotec”, Германия), содержащими антитела против CD2, CD3, CD28 и цитокинами TGF-β (5 нг/мл) и IL-2 (166 нг/мл) (“Miltenyi Biotec”, Германия). Концентрации цитокинов были определены исходя из информации об их биологической активности, предложенной на сайте производителя. После внесения гликоделина клетки культивировали 72 ч при 5% CO2 и 37°C.

После культивирования производили окрашивание клеток с использованием панели идентификации Treg (#362251, “Biolegend”, США). В панель входят витальный краситель 7-AAD и антитела к поверхностным антигенам (APC-CD25, APC/Cyanine7-CD3, PE/Cyanine7-CD127 (IL-7Rα), FITC-CD4). Тактика гейтирования включала в себя следующие этапы: на графике FSC/SSC выделяли общий пул лимфоцитов, затем живые T-лимфоциты (7-AAD-CD3+), из них гейтировали T-хелперы (CD4+), внутри популяции которых оценивали процент Treg (CD25highCD127–/low) (рис. 1А). Итоговый фенотип Treg: 7-AAD–CD3+CD4+CD25highCD127–/low. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре CytoFlex S (“Beckman Coulter”, США).

Рис. 1.

Влияние гликоделина на уровень Treg (CD25highCD127–/low) в культуре изолированных Т-хелперов. А) Показаны гистограммы гейтирования Treg и результаты одного эксперимента, контроль без гликоделина; Б) Результаты серии экспериментов (Me (Q1–Q3), n = 5). Примечание: здесь и в рис. 2, * p < 0.05 – достоверные по w-критерию Вилкоксона различия между контролем без активаторов и контролем с активатором, **p < 0.05 – между контролем с активатором и пробами с гликоделином. Контроль активации – пробы без активирующих частиц и цитокинов, контроль гликоделина – пробы без гликоделина.

Для оценки пролиферативного статуса использовали метод дифференциального гейтирования на графике светорассеяния по размеру и гранулярности клеток. Так, после 72 ч культивирования активированные СD4+-клетки были представлены тремя популяциями: неделящиеся клетки в характерном для них регионе, пролиферирующие клетки, образующие смещение вправо и вверх и апоптотирующие клетки. Количество клеток внутри каждой популяции выражали в процентах от общего количества клеток [9]. Далее файлы данных были обработаны в программе “KALUZA Analysis Software” (Beckman Coulter, США).

Статистическую обработку полученных результатов данных проводили в программе GraphPad Prism 6 при помощи критерия Вилкоксона. Результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Me (Q1–Q3)). Различия считались достоверными при p <0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Показано, что присутствие в культурах активационных частиц, нагруженных антителами против CD2/CD3/CD28, а также цитокинов TGF-β и IL-2, приводило к существенному повышению уровня Treg в культурах Т-хелперов, что свидетельствует об адекватности экспериментальной системы (рис. 1 а, б).

При изучении влияния GdA на дифференцировку Treg установлено, что данный белок, вне зависимости от источника получения, практически не оказывал достоверного влияния на уровень CD4+CD25highCD127–/low в монокультуре Т-хелперов. Однако низкая концентрация рекомбинантного гликоделина бактериального происхождения (GdA 0.2 мкг/мл) вызывала снижение уровня Treg в культурах клеток (рис. 1 б).

Учитывая тот факт, что процессы пролиферации и дифференцировки тесно связаны, мы оценили пролиферативный статус Т-хелперов в культуре клеток. Показано, что GdA практически не оказывал эффекта на распределение клеток по пролиферативному статусу, за исключением низкой концентрации рекомбинантного гликоделина бактериального происхождения (GdA 0.2 мкг/мл), которая снижала количество пролиферирующих клеток, одновременно повышая количество не пролиферирующих клеток. Таким образом, низкая концентрация GdA угнетала пролиферацию активированных Т-хелперов, и за счет этого эффекта снижалось количество Treg в данной экспериментальной модели (рис. 2).

Рис. 2.

Влияние гликоделина на пролиферативный статус Т-хелперов (M, n = 5).

Важно отметить, что достоверный эффект оказывала только низкая концентрация рекомбинантного гликоделина, что может объясняться его способностью регулировать экспрессию своего предположительного рецептора – CD45 [7]. По-видимому, высокие концентрации белка не вызывают достоверных эффектов из-за рефрактерного состояния клеток, связанного с переизбытком сигнала. Стоит также отметить, что гликозилированный рекомбинантный mGdA, полученный в клетках млекопитающих HEK293, не оказывал достоверных эффектов на пролиферацию и дифференцировку Treg.

В целом выявленный угнетающий эффект гликоделина является довольно неожиданным, поскольку для успешного течения беременности необходимо повышение уровня Treg [10]. В то же время гликозилированный гликоделин, который близок по своей структуре нативному, не оказывал достоверных эффектов на дифференцировку Treg. Стоит отметить, что ранее мы показали, что альфа-фетопротеин способен подавлять дифференцировку Treg in vitro [11]. Известно, что хорионический гонадотропин [12] и трофобластический гликопротеин [13] повышают количество Treg в культуре, а также усиливают функциональную активность этик клеток. По-видимому, белки, ассоциированные с беременностью, оказывая по отдельности разнонаправленные эффекты, в совокупности формируют вектор иммунной толерантности.

Таким образом, было показано, что только низкая концентрация (0.2 мкг/мл) рекомбинантного GdA бактериального происхождения снижала количество Treg в экспериментальной системе in vitro. В то же время рекомбинантный mGdA, полученный в клетках млекопитающих HEK293, не оказывал достоверных эффектов на дифференцировку Treg. В целом мы впервые продемонстрировали прямые эффекты рекомбинантного гликоделина на дифференцировку Treg.

Список литературы

  1. Tatarinov Yu.S. Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein, placentaspecific alpha-1-and alpha-2-microglobulins. // In: Pregnancy Proteins: Biology, Chemistry and Clinical Application. London. 1982. 463 p.

  2. Posiseeva L.P., Gerasimov A.M., Petrova U.L. // Problemy Reproduktsii (Russian Journal of Human Reproduction). 2020. V. 26. № 3. P. 1–22.

  3. Cui J., Liu Y., Wang X. // Frontier Immunology. 2017. V. 8. P. 1685.

  4. Bochkova M.S., Zamorina S.A., Timganova V.P., Khramtsov P.V., Rayev M.B. // Medical Immunology (Russia). 2019. V. 21. № 4. P. 603–616.

  5. Figueiredo A.S., Schumacher A. // Immunology. 2016. V. 148. № 1. P. 13–21.

  6. Ochanuna Z., Geiger-Maor A., Dembinsky-Vaknin A., Karussis D., Tykocinski M.L., Rachmilewitz J. // PLoS ONE. 2010. V. 5. P. e12868.

  7. Rachmilewitz J., Borovsky Z., Riely G.J., Miller R., Tykocinski M.L. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 14059–14065.

  8. Mishan-Eisenberg G., Borovsky Z., Weber M.C., Gazit R., Tykocinski M.L., Rachmilewitz J. // J. Immunol. 2004. V. 173. P. 5524–5530.

  9. Halttunen M., Kämäräinen M., Koistinen H. Glycodelin: a reproduction-related lipocalin // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1482. P. 149–156.

  10. Vesela R., Dolezalova L., Pytlik R., Rychtrmocova H., Mareckova H., Trneny M. // Cellular Immunology. 2011. V. 271. P. 78–84.

  11. Chereshnev V.A., Timganova V.P., Zamorina S.A., Bochkova M.S., Khramtsov P.V., Kropaneva M.D., Raev M.B. // Dokl. Biol. Sci. 2017. V. 477. № 1. P. 248–251.

  12. Martínez F.F., Knubel C.P., Sánchez M.C., Cervi L., Motrán C.C. // Eur. J. Immunol. 2012. V. 42. № 6. P. 1573–1584.

  13. Poloski E., Oettel A., Ehrentraut S., Luley L., Costa S.D., Zenclussen A.C., Schumacher A. // Biol. Reprod. 2016. V. 94. № 5. P. 106.

Дополнительные материалы отсутствуют.

Инструменты

следующая статья выпуска предыдущая статья выпуска содержание выпуска

Доклады Российской академии наук. Науки о жизни

Архивы выпусков Информация о журнале Отправить рукопись в журнал