Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 507, № 1, стр. 542-548

Современные методы лечения злокачественных опухолей часто включают различные подходы к стимуляции противоопухолевой активности иммунной системы. Так, лекарственные препараты на основе моноклональных антител активируют антителозависимый клеточный фагоцитоз. Использование бактериальных продуктов или других стимуляторов классической активации макрофагов активирует антителонезависимую цитотоксичность последних. При этом, несмотря на успехи данных методов лечения, остается неясным, почему в большом количестве случаев развивается устойчивость опухолей к проводимой терапии. Одним из потенциальных механизмов является приобретение опухолевыми клетками устойчивости к цитотоксической активности макрофагов.

Макрофаги, ассоциированные с опухолью (МАО), считаются основным регулятором противоопухолевого иммунного ответа и, как правило, характеризуются противовоспалительным фенотипом М2 [1]. Продуцируя факторы роста, протеолитические ферменты и белки-ингибиторы иммунных контрольных точек МАО способствуют прогрессии опухоли [2]. Все терапевтические стратегии, мишенями которых являются макрофаги, направлены на перепрограммирование данного типа клеток с противовоспалительного на провоспалительный фенотип. Однако данная тактика не нашла применения в терапевтической практике ввиду довольно низкой эффективности [3, 4]. Каковы же тогда механизмы взаимодействия опухолевых клеток и цитотоксических макрофагов? В ответ на активность иммунной системы опухолевые клетки приобретают устойчивость к цитотоксичности [5]. Однако клеточные и молекулярные механизмы этого явления на данный момент практически не изучены.

Таким образом, целью данной работы стало выявление генов, потенциально ассоциированных с приобретением опухолевыми клетками устойчивости к цитотоксической активности макрофагов.

В качестве биологической модели использовали клетки немелкоклеточного рака легкого H1975 и их устойчивые производные – H1975(LPS), полученные в результате кокультивирования с цитотоксическими макрофагами, стимулированными липополисахаридом [5].

Исследование выполнено в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей. Проведение исследования одобрено комитетом по биомедицинской этике ФГБУ “НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина” Минздрава России (протокол от 01.12.2021).

Приготовление кДНК библиотек и секвенирование на платформе Illumina HiSeq 2000 выполнялись в соответствии с протоколами Illumina для RNA-seq. Функциональная аннотация генов проводилась с использованием пакета R Homo.sapiens, Team BC (2015) и базы данных Ensembl. Анализ   насыщенности метаболических путей проводили для достоверно дифференциально экспрессирующихся генов (ДЭГ) с использованием пакета R fgsea. Функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов была проведена с использованием базы данных кластеров ортологичных групп генов (COG).

На первом этапе исследования проанализировали степень злокачественности полученных клеток, по сравнению с исходными клетками H1975. Для этого провели оценку пролиферации in vitro и скорости роста подкожных ксенографтов in vivo. Повышенная скорость деления является одной из основополагающих характеристик злокачественных клеток. Анализ динамики роста клеточных линий проводился при помощи прямого подсчета количества клеток в камере Горяева каждые 24 ч. Для оценки скорости роста клеток in vivo использовали самок бестимусных мышей линии BALB/c Nude в возрасте 6–8 нед, по 5 животных в каждой группе. Каждому животному подкожно прививалось по 2 опухоли, прививочная доза составляла 5 × 10⁶ клеток. Продолжительность эксперимента составляла 3 нед. Образовавшиеся опухоли использовали для гистологического анализа. Результаты экспериментов представлены на рис. 1.

Рис. 1.

Исследование пролиферативных характеристик клеточных линий, устойчивых к цитотоксической активности макрофагов. (а) Динамика роста клеток НМРЛ H1975 и Н1975(LPS) in vitro и in vivo, (б) внешний вид подкожных ксенографтов, полученных в результате введения клеток НМРЛ H1975 и Н1975(LPS) иммунодефицитным мышам BALB/c Nude, (в) гистологическое окрашивание срезов опухолей подкожных ксенографтов гематоксилин-эозином, увеличение 100х.

Производные клеточной линии немелкоклеточного рака легкого, устойчивые к цитотоксической активности, статистически достоверно делятся быстрее контрольной линии – среднее время удвоения составляет 0.6 сут, в то время как для контрольной линии – 1.3 сут. Проведенные эксперименты на животных также показали, что клетки, обладающие устойчивостью к цитотоксической активности макрофагов, характеризуются более высокой скоростью роста подкожных ксенографтов по сравнению с клетками исходной линии. Дополнительно опухоли, образуемые клетками, устойчивыми к цитотоксической активности макрофагов, характеризовались значимо большим размером, большим количеством очагов некроза и повышенной васкуляризацией, что свидетельствует об их более высоком злокачественном потенциале. Полученные результаты свидетельствуют о том, что цитотоксические макрофаги способствуют отбору более малигнизированных опухолевых клеток, тем самым способствуя опухолевой прогрессии.

На следующем этапе работы проведен анализ транскриптома исследуемых клеточных линий. В результате проведенного анализа обнаружено 283 дифференциально экспрессирующихся гена, с достоверно (log2 fold change >1, FDR corrected p-value <0.05) изменяющейся экспрессией в образцах H1975 (LPS) по сравнению с контролем. Среди них экспрессия 165 генов увеличивалась в образцах H1975 (LPS) по сравнению с контролем, экспрессия 118 генов снижалась. Результаты транскриптомного анализа были подтверждены для части генов при помощи количественной ОТ-ПЦР. На основе базы данных KEGG с использованием пакета fgsea были выявлены достоверно обогащенные сигнальные пути, потенциально вовлеченные в опухолевую прогрессию, например, интегрин-зависимый сигнальный путь и TGFβ сигнальный путь (рис. 2).

Рис. 2.

Транскриптомный анализ клеток НМРЛ, устойчивых к цитотоксической активности макрофагов. (a) Диаграмма рассеяния (Volcano plot), отображающая дифференциальную экспрессию генов; (б) Тепловая карта (Heatmap) дифференциально экспрессирующихся генов; (в) анализ насыщенности метаболических путей на основе базы данных KEGG.

Помимо анализа дифференциально экспрессирующихся белок-кодирующих генов, дополнительно проведен анализ некодирующих РНК, экспрессия которых достоверно изменялась в экспериментальных образцах по сравнению с контролем. Все они относились к классу длинных некодирующих РНК (днкРНК). Результаты представлены в табл. 1.

Так как одним из основных изменений клеточных характеристик являлось усиление пролиферативных свойств клеток, для последующего анализа проведен выбор отдельных генов, потенциально вовлеченных в регуляцию пролиферации. Результаты представлены в табл. 2.

Проведенный анализ сравнения метаболических путей между исследуемыми группами позволил идентифицировать сигнальные пути, вовлеченные в регуляцию клеточной пролиферации. К таким сигнальным путям относятся, в частности, интегрин-зависимые сигнальные пути. Известно, что в процессе клеточной адгезии после взаимодействия интегринов со своими лигандами, в основном белками внеклеточного матрикса, к этому комплексу привлекаются различные сигнальные молекулы, в частности нерецепторная тирозинкиназа FAK, которая в результате последовательных фосфорилирований может играть существенную роль в активации Ras-зависимых сигнальных путей, что, в конечном итоге, приводит к активации ERK1/2 и усилению подвижности клеток [6]. Обратив внимание на усиление экспрессии интегринов, выдвинуто предположение, что возможными кандидатами на роль “активаторов” пролиферации могут служить MAP-киназы. Например, в литературе описаны механизмы активации пролиферации посредством p38 за счет активации с-Myc и последующей инициации митотических циклов с понижением потребности клетки во внешних митогенных сигналах [7]. Также стоит отметить, что при прогрессии опухолей p38 часто ассоциирована с инвазивностью и химиорезистентностью различных солидных новообразований, а также со снижением безрецидивной выживаемости пациентов [8, 9].

Сигнальные пути, активируемые цитокином TGF-β, также регулируют различные биологические процессы, например деление клеток, их миграцию и дифференцировку, причем его эффекты варьируют в зависимости от типа клеток-мишеней и их микроокружения. Одним из основных механизмов действия TGF-β является взаимодействие с белками Smad, приводящее к регуляции множества генов. С другой стороны, TGF-β может активировать функцию МАР-киназ, в частности p38, через Smad-независимые механизмы. Также необходимо отметить, что по результатам транскриптомного секвенирования было выявлено повышение экспрессии остеопротегерина (OPG), являющегося представителем 11b суперсемейства рецепторов TNF (TNFRSF11B). Данный рецептор представляет собой растворимый белок, основная функция которого – ингибирование TRAIL – индуцированного апоптоза. Для различных солидных опухолей показана ассоциация содержания OGP с агрессивностью опухолей [10–13]. Показано, что секреция OPG опосредована активацией двух сигнальных каскадов, а именно p38 и ERK1/2, которые, в свою очередь, активируются в ответ на влияние цитокина IL-1β, производимого макрофагами [14], что согласуется с полученными результатами.

Стоит отметить, что в изучаемых клетках, обладающих устойчивостью к цитотоксической активности, наблюдалось снижение экспрессии фосфатазы DUSP1, что также может объяснять повышение пролиферативных свойств клеток посредством активации киназы p38. Наблюдаемое нами снижение экспрессии некоторых других генов, например NKD2, также может объяснять усиление пролиферации клеток посредством других механизмов, таких как Wnt-сигнальный путь [15].

В данной работе также выявлены изменения в экспрессии длинных некодирующих РНК. Так, длинные некодирующие РНК (lncRNA) IGFL2-AS1 и POT1-AS1 участвуют в развитии и метастазировании рака желудка [16–18]. Помимо этого, для IGFL2-AS1 показано, что она принимает непосредственное участие в формировании пролиферативного фенотипа клеток колоректального рака. Для длинной некодирующей РНК MBNL1-AS1 показано, что она играет важную роль в развитии рака мочевого пузыря [19]. Также стоит обратить внимание, что экспрессия двух некодирующих РНК LINC01291 и LINC01508 снижалась в исследуемых образцах по сравнению с контролем. Известно, что экспрессия LINC01508 снижена в цисплатин-резистентных клетках рака яичников. Оверэкспрессия LINC01508 повышает чувствительность клеток РЯ к цисплатину in vitro и in vivo, но является маркером плохого прогноза. Повышенный уровень LINC01508 может подавлять устойчивость клеток к цисплатину посредством ингибирования Hippo-YAP сигнального пути [20].

Таким образом, транскриптомный анализ позволил впервые выявить в клетках рака легкого, устойчивых к цитотоксическому действию макрофагов, изменение регуляции ряда ключевых сигнальных путей, каждый из которых может вносить свой вклад в ростовые характеристики опухолевых клеток. На основании полученных данных были выявлены гены-мишени, отвечающие за приобретение опухолевыми клетками устойчивости к цитотоксическому действию макрофагов.