Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 507, № 1, стр. 536-541

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время от 300 до 400 млн человек во всем мире страдают от хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Это заболевание ежегодно уносит жизни до 3 млн пациентов [1]. По оценкам экспертов, в глобальном масштабе ХОБЛ приводит к экономическим издержкам в размере 2.1 трлн. долларов США. Ожидается, что к 2030 г. эти цифры могут увеличиться более чем вдвое [1].

Несмотря на риск развития серьезных побочных эффектов, ингаляционные глюкокортикостероиды (ИГКС), лекарственные средства (ЛС) с противовоспалительным механизмом действия широко используются для лечения ХОБЛ. Добавление ИГКС к бронходилататору (длительно действующему β2-агонисту (ДДБА) или комбинации ДДБА и длительно действующего антихолинергического препарата) снижает риск будущих обострений у пациентов с предшествующими обострениями ХОБЛ [2]. Однако глюкокортикостероиды (ГКС) имеют ограниченную эффективность в снижении риска смерти и уровня провоспалительных медиаторов, улучшении функции легких и качества жизни пациентов с ХОБЛ [3, 4].

Исследования, направленные на поиск ЛС, способных потенцировать действие ГКС, привели к выявлению нортриптилина как ЛС, обладающего такими свойствами [5, 6]. Нортриптилин относится к группе трициклических антидепрессантов (ТЦА) и одновременно является активным метаболитом амитриптилина, который также принадлежит к группе ТЦА. Нортриптилин используется для лечения депрессии, тревоги и никотиновой зависимости у пациентов с ХОБЛ [7, 8]. Проведенные нами ранее исследования позволили установить синергичное супрессирующее действие нортриптилина и ГКС в отношении секреции цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (МКПК) больных ХОБЛ [9, 10].

Привлечение лимфоцитов и моноцитов в легкие, где они продуцируют провоспалительные медиаторы, происходит под воздействием хемокинов – лигандов для хемокиновых рецепторов, локализованных на поверхности клеток. Полагают, что основное значение в перемещении клеток крови пациентов с ХОБЛ в легкие играют лиганд-рецепторные  пары  CCR5-CCL5  и  СXCR3-CXCL9/CXCL10/CXCL11 [11, 12]. На это в том числе указывают данные об увеличенной миграции МКПК пациентов с ХОБЛ в направлении CCL5, CXCL9, CXCL10 и CXCL11 по сравнению со здоровыми курящими и некурящими людьми [13]. Сообщается о подавлении хемотаксиса полиморфноядерных клеток в места воспаления под влиянием нортриптилина [14]. Однако сведения о способности этого ЛС потенцировать эффекты ГКС, связанные с угнетением миграции МКПК, отсутствуют.

Целью исследования явилось оценить способность комбинации нортриптилина и ГКС влиять на перемещение лимфоцитов и моноцитов крови пациентов с ХОБЛ в направлении хемокинов CCL5 и CXCL10.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика пациентов. Донорами крови для проведения исследования явились 8 больных ХОБЛ (6 мужчин и 2 женщины), в возрасте 61.5 (59.0–68.3) лет [медиана (25-й – 75-й процентили)], имеющих индекс курящего человека 39.0 (16.3–43.8) пачка/лет и 2–3 степень тяжести заболевания (в соответствии с критериями Глобальной инициативы по хронической обструктивной болезни легких). Критериями исключения из исследования явились наличие у пациентов бронхиальной астмы, заболеваний соединительной ткани с изменениями функции дыхательной системы, онкологических и аутоиммунных заболеваний, нарушений свертывающей системы крови, а также прием системных ГКС или обострение ХОБЛ в течение 6 нед до начала исследования.

Выделение МКПК. Венозную кровь у пациентов забирали утром натощак в объеме 15 мл в пробирку, содержащую гепарин натрия (Белмедпрепараты, Беларусь) в концентрации 10 ЕД/мл в качестве антикоагулянта. МКПК выделяли из периферической крови путем центрифугирования на градиенте плотности 1.077 с использованием раствора Lymphopure (Biolegend, США). Клетки ресуспендировали в концентрации 1 × 10⁶/мл в культуральной среде RPMI 1640 (Gibco, США), обогащенной 1% фетальной телячьей сывороткой (ФТС, Capricorn Scientific, Германия).

Инкубация МКПК с лекарственными средствами. В стерильные пробирки помещали 1 мл клеточной суспензии и инкубировали с ГКС будесонидом (10 нM, Glentham Life Sciences Ltd, Великобритания), нортриптилином (1 и 10 мкМ, Sigma-Aldrich, США) или их комбинацией в увлажненной 5% CO₂/95% воздушной среде при 37°C. Спустя 1 ч 100 мкл клеточной суспензии (100 000 клеток) переносили в верхние камеры (съемные вставки) 24-луночного миграционного планшета, имеющие поры диаметром 5 мкм (Costar Corning, США). В нижние камеры миграционного планшета помещали 600 мкл миграционного буфера, состоящего из культуральной среды RPMI 1640, обогащенной 1% ФТС и хемокинами CCL5 (10 нМ, R&D systems, США) или CXCL10 (10 нМ, Gibco, США). В качестве нестимулированного контроля использовали миграционный буфер, не содержащий хемокины. Далее планшеты инкубировали при 37°C, 5% CO₂/95% атмосферного воздуха. По окончании 2 ч клетки, мигрировавшие в нижнюю камеру, собирали, отмывали при помощи фосфатного солевого буфера (ФСБ, Cell Wash, BD Biosciences, Польша) (условия центрифугирования: 500 g, 5 мин, комнатная температура) и ресуспендировали в ФСБ. Добавляли коктейль моноклональных антител, состоящий из CD3-FITC/СD14-PE/CD19-ECD/ CD4-PerCP-Cy5.5/CD56-PC7/CD8-APC/CD45-APC Alexa Fluor 750 (Beckman Coulter, Франция; Exbio, Чехия; BD Biosciences, США), после чего клетки инкубировали в темноте в течение 20 мин при температуре 4°С. Далее клетки отмывали при помощи 3 мл ФСБ, содержащего 0.2% бычий сывороточный альбумин (BD Biosciences, США), и фиксировали путем внесения в пробирки 300 мкл 1% раствора параформальдегида. Используя проточный цитометр Navios (Beckman Coulter, США), настроенный на среднюю скорость потока клеток, подсчитывали их количество в течение 100 с.

Образцы анализировали с использованием программного обеспечения Kaluza (Beckman Coulter). T-хелперы идентифицировали как CD45⁺CD3⁺CD4⁺, цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) – CD45⁺CD3⁺CD8⁺, B-лимфоциты – CD45⁺CD19⁺, NK-клетки – CD45⁺CD3^-CD56⁺, моноциты – CD14⁺ клетки.

Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программы GraphPad Prism версия 7.00 (GraphPad Software, США). Оценка результатов исследования проводилась методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным попарным сравнением показателей с помощью критерия Тьюки. При всех видах статистического анализа критическое значение уровня значимости принимали как равное 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании будесонид подавлял миграцию ЦТЛ, NK-клеток, B-лимфоцитов и ускорял перемещение моноцитов к хемокину CCL5 (рис. 1). Схожим образом ГКС влияли на хемотаксис NK-клеток, B-лимфоцитов и моноцитов в направлении CXCL10, но не были способны изменить миграцию к этому хемокину T-хелперов и ЦТЛ (рис. 2).

Рис. 1.

Влияние нортриптилина и будесонида на хемотаксис мононуклеарных клеток периферической крови в направлении CCL5. Представлены графики, демонстрирующие влияние нортриптилина (Нортр, 1 и 10 мкМ), будесонида (Буд, 10 нМ) и их сочетания на миграцию Т-хелперов (а), цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (б), NK-клеток (в), В-лимфоцитов (г) и моноцитов (д), индуцированную 10 нМ CCL5. Здесь и на рис. 2: результаты представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего; n = 8. * p < 0.05 по сравнению с контролем (клетками крови, находившимися в присутствии хемокина, но в отсутствии лекарственных средств); ^♦p < 0.05 по сравнению с Буд 10 нМ; ^#p < 0.05 по сравнению с Нортр 10 мкМ; ^§p < 0.05 по сравнению с Нортр 1 мкМ.

Рис. 2.

Влияние нортриптилина и будесонида на хемотаксис мононуклеарных клеток периферической крови в направлении CXCL10. Представлены графики, демонстрирующие влияние нортриптилина (Нортр, 1 и 10 мкМ), будесонида (Буд, 10 нМ) и их сочетания на миграцию Т-хелперов (а), цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) (б), NK-клеток (в), В-лимфоцитов (г) и моноцитов (д), индуцированную 10 нМ CXCL10.

Добавление к клеточной суспензии нортриптилина в обеих концентрациях (1 и 10 мкМ) приводило к снижению миграции T-хелперов, ЦТЛ, NK-клеток и B-лимфоцитов в направлении CCL5. В минимальной концентрации (1 мкМ) нортриптилин не влиял на перемещение ЦТЛ и моноцитов к CXCL10, зато подавлял хемотаксис к этому лиганду рецепторов CXCR3 Т-хелперов, NK-клеток и B-лимфоцитов. Вместе с тем применение ТЦА в более высокой концентрации (10 мкМ) продемонстрировало его выраженное ингибирующее действие на миграцию к CXCL10 субпопуляций лимфоцитов и активирующее влияние на перемещение к нему моноцитов.

Комбинация будесонида и нортриптилина (1 мкМ) не имела преимуществ по сравнению с одним будесонидом в отношении миграции МКПК к CCL5, но превосходила способность ГКС подавлять хемотаксис лимфоцитов к CXCL10. Сочетанное использование будесонида и нортриптилина в концентрации 10 мкМ сопровождалось более существенным (ингибирующим – на лимфоциты, активирующим – на моноциты) влиянием на хемотаксис клеток крови к CCL5 и CXCL10 по сравнению с эффектом одного будесонида. Способность изменять миграцию лимфоцитов крови к обоим хемокинам оказалась лишь незначительно лучше у комбинации нортриптилина (10 мкМ) с будесонидом, чем у одного ТЦА в той же концентрации, тогда как сочетанное действие этих же лекарственных средств на хемотаксис моноцитов крови было более выраженным по сравнению с одним нортриптилином (10 мкМ).

Как известно, у пациентов с ХОБЛ наблюдается скопление лимфоцитов в легочной ткани, где они синтезируют провоспалительные цитокины, металлопротеиназы, цитотоксические гранулы (перфорины, гранзим В). Эти белки способствуют привлечению в дыхательные пути нейтрофилов и разрушают протеины внеклеточного матрикса легких с последующим развитием эмфиземы [15, 16]. Приведенные в настоящем исследовании данные в совокупности со значением лимфоцитов в патогенезе ХОБЛ дают основание полагать, что нортриптилин как самостоятельно, так и в совокупности с будесонидом, может замедлить прогрессирование ХОБЛ за счет снижения количества мигрировавших в легкие лимфоцитов.

Сообщается, что под влиянием ГКС наступает активация популяции противовоспалительных моноцитов, которые проявляют повышенную способность к миграции в очаг воспаления, продуцируют противовоспалительные медиаторы, обладают высокой фагоцитарной активностью и ограничивают активацию Т-лимфоцитов, что в конечном счете приводит к разрешению воспалительного процесса [17]. Учитывая такие сведения, мы предполагаем, что повышение хемотаксиса моноцитов к хемокинам CCL5 и CXCL10 под влиянием ГКС будесонида и нортриптилина (10 мкМ), выявленное в нашем исследовании, может быть связано с мобилизующим действием ЛС на противовоспалительные моноциты, что в последующем может способствовать подавлению воспаления. Для подтверждения данной гипотезы требуется проведение дополнительных исследований, в которых будет определен фенотип мигрировавших моноцитов.

Обобщая полученные данные, можно сделать заключение, что нортриптилин (10 мкМ), самостоятельно и в сочетании с будесонидом (10 нМ), подавляет миграцию к CCL5 и CXCL10 Т-хелперов, ЦТЛ, NK-клеток и B-лимфоцитов крови пациентов с ХОБЛ, а также ускоряет перемещение к этим хемокинам моноцитов крови. Комбинация нортриптилина (10 мкМ) и будесонида обладает более выраженным действием на миграцию клеток крови больных ХОБЛ (ингибирующим – на субпопуляции лимфоцитов и активирующим – на моноциты), чем один будесонид.