Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 507, № 1, стр. 499-503

ВВЕДЕНИЕ

Серьезной проблемой в терапии рака остается разработка новых подходов к лечению, которые будут избирательно воздействовать на опухолевые клетки с минимальным воздействием на здоровые ткани [1]. Использование в качестве мишеней белков, формирующих метаболическое перепрограммирование, является одним из наиболее перспективных направлений противоопухолевой терапии [2]. Одной из важнейших перестроек в метаболизме раковых клеток является формирование эффекта Варбурга. Успехи в понимании сложных клеточных и молекулярных механизмов, связанных с эффектом Варбурга и другими метаболическими перестройками, стали основой для создания новых специфических агентов [3]. Однако одна из ключевых проблем, связанных с соединениями, препятствующими гликолизу в опухолевых клетках, заключается в том, что они препятствуют метаболизму нормальных клеток. Несмотря на успешные доклинические испытания, многие новые противоопухолевые препараты с антигликолитической активностью не прошли I или II фазы клинических испытаний [4]. Эта ситуация требует поиска и разработки селективных антиметаболических средств с низкой токсичностью или использования методов адресной доставки, улучшающих биораспределение и снижающих токсические побочные эффекты. Адресная доставка лекарств с помощью липосом является одним из подходов к снижению токсического эффекта и повышению терапевтического индекса [5]. Среди ингибиторов гликолиза можно выделить ряд соединений, обладающих высоким синергизмом с липосомами благодаря своим индивидуальным свойствам. В частности, такой ингибитор, как йодоацетат (ЙА), обладает противоопухолевой активностью и наименьшим токсическим потенциалом по сравнению с другими аналогичными ингибиторами гликолиза [5, 6]. Цель настоящего исследования заключалась в оценке противоопухолевой активности этого ингибитора с использованием липосом для снижения его системной токсичности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Терапевтическое действие ингибитора оценивали на мышах (самцах) линии C57BL/6j массой 25–30 г, полученных из СПФ вивария лабораторных животных ИЦиГ СО РАН (свидетельство № 10305258095, Новосибирск, Россия). Исследования проводились с соблюдением правил лабораторной практики при доклинических исследованиях в Российской Федерации (ГОСТ Р 51000.3-96 и ГОСТ Р 51000.4-96), международных рекомендаций “Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или других целей”. Научные цели” (Страсбург, 1986 г.) и директивы Европейской комиссии 86/609/ЕЕС для экспериментов на животных.

Операции проводили с использованием изофлюрана (Baxter, США) на станции анестезии животных (Braintree Scientific, EZ-7000-320, США). Для внутривенного введения использовали катетер 27G длиной 10 мм (Sci-cat, Россия). Вены животных катетеризировали по протоколу за два дня до начала забора крови или терапии [21 ] .

Кровь для биохимического анализа брали из яремной вены и затем собирали в пробирки, предварительно заполненные гепарином (B. Braun Melsungen, Германия). Кровь анализировали с помощью биохимического анализатора Architect (Abbot, США).

Для получения эмульсии полых липосом использовали 1,2-дипальмитоил-глицеро-3-фосфохолин и холестерин (Sigma Aldrich, США). Ингибитор гликолиза йодоацетат (ЙА, Sigma-Aldrich, США) помещали в камеру экструдера, содержащую липосомальную эмульсию. Суспензию эмульсии липидных пленок и препаратов фильтровали 12 раз через поликарбонатные фильтры диаметром 100 или 400 нм (Sartorius, Германия) при температуре 25–55°C в экструдере и давлении аргона в диапазоне от 2 до 10 МПа. Полученные липосомы очищали от невключенного компонента с помощью диализной мембраны (ROTH, США).

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили для анализа количества включенного агента в липосомы. В качестве неподвижной фазы использовали аминопропилсиликагель, в качестве подвижной фазы – раствор ацетонитрила (УФ-ИК-ВЭЖХ (градиент) ACS, Panreac, Испания) с водой в соотношении 50: 50 с добавлением 60 ммоль/л уксусной кислоты (Scharlab, Испания) и формиата аммония (ACROS Organics, США). Йодоацетат определяли на колонке ZorbaxNH₂ размером 4.6 × 150 мм, 5 мкм (Agilent Technologies, США) при длине волны λ = 260 нм на жидкостном хроматографе Aligen 1260 (Agilent Technologies, США) с детектором на диодной матрице.

Моделирование карциномы легкого Льюис (LLC) у животных проводили путем одновременной инокуляции в мышцу бедра 1.5 млн опухолевых клеток LLC в 0.2 мл 0.9% NaCl. Объем бедра и размер метастазов определяли штангенциркулем. Объем опухоли рассчитывали как (длина × × ширина²)/2. Количество метастазов в легкие определяли путем подсчета количества метастатических узелков на поверхности легких. Фотографии легких были сделаны в проходящем свете с помощью камеры Canon DSLR.

В исследованиях на животных размер группы составлял 6–8 животных. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле: ТРО = = (V_c – V_t) × 100%/V_c (V_c – средний объем опухоли в контрольной группе; V_t – средний объем опухоли в группе, получавшей лечение). Уровень ингибирования метастазов в легкие (ИМ) рассчитывали по формуле: ИМ = (М_к – М_т) × 100%/М_к (М_к – средняя площадь метастазов в легких в контрольной группе; М_т – средняя площадь метастазов в легких в группе лечения.

В схеме лечения йодацетатом в липосомах (Лип-ЙА) и самостоятельной форме использовали введние препаратов один раз в сутки в хвостовую вену в течение 4 дней в максимально переносимой дозе (9 мг/кг/сут) для краткосрочного режима. Для курсовой терапии, продолжительность которой составила 12 дней, липосомы вводили через катетер (Sci-cat, Россия), введенный в яремную вену (схема введения № 2). Животные, получавшие курсовую терапию, были выведены из эксперимента на 18-е сутки. При оценке показателей биохимии крови животные получили дозу Лип-ЙА однократно и дважды в сутки с промежутком в 4 ч.

Экспериментальные данные представлены в виде средних значений и стандартного отклонения среднего. Критерий Манна–Уитни использовали для сравнения различий между независимыми выборками с распределением, отличным от нормального. Значение p менее 0.05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе для оценки содержания ЙА в липосомах потребовалось разработать валидный метод количественного анализа, а также оценить его токсикологический профиль и подобрать оптимальную схему лечения.

В аналитических исследованиях для метода ВЭЖХ были подобранны оптимальные хроматографические условия. Коэффициент разрешения между пиками Rs для ЙА составил 13.4 при требовании минимального значения 1.5 ед. Количественный анализ количества ЙА в липосомах выявил, что независимо от их размера как при диаметре 100 нм, так и 400 нм предельная концентрация составляет 9 мг/кг (рис. 1). В результате испытаний мы установили, что оптимальным вариантом для приготовления и исследований методом экструзии являются липосомы с размером 400 нм.

Рис. 1.

Хроматограмма йодоацетата, инкапсулированного в липосому 400 нм. Пик йодоацетата на 9 мин, пик компонентов липосом с растворителем на 2 мин.

Предварительную оценку токсического влияния ЙА для свободной и липосомальной форм ЙА при курсовом его введении через яремную вену проводили по биохимическим показателям крови, которые отражают основные пути повреждения организма ингибитором. Анализ показателей крови выявил, что наиболее существенные отклонения при острой интоксикации ЙА коснулись показателей АсАТ, ЛДГ и общей амилазы (табл. 1).

Однако полученные результаты демонстрируют, что, несмотря на увеличение этих показателей в 10–20 раз, это происходит на фоне нормального уровня активности АлАТ, являющейся маркером целостности клеток печени. Этот безопасный для печени профиль придает препарату большой потенциал в качестве липосомальной формы, поскольку известно, что они накапливаются в печени, селезенке и непосредственно в опухолевых образованиях [7]. Наши данные о влиянии иммерсионного ЙА в липосомы показали высокую эффективность в снижении системной токсичности препарата. Все показатели были на уровне нормальных значений после курсового введения как при однократном приеме (доза 9 мг/кг/сут), так и при двукратном варианте введения (18 мг/кг/сут).

Исследование противоопухолевой активности Лип-ЙА показало по схеме терапии № 1, что их противоопухолевая активность по сравнению с его самостоятельной формой была снижена в отношении торможения роста метастазов, но несколько повышалась в отношении первичного очага. Так, максимальная эффективность ТРО ингибитора ЙА в свободной форме достигала 15%. В группе лечения Лип-ЙА терапевтический эффект увеличивался до 25%, что является умеренным показателем противоопухолевого эффекта для данной модели. Среднее значение ИМ для группы составило около 45% (рис. 2 и 3). Лип-ЙА не ингибировал рост метастазов. При этом анализ внутригруппового разброса показателей говорит о том, что более длительный курс введения Лип-ЙА, возможно, может изменить эту ситуацию.

Рис. 2.

Площадь метастазов в легких. ЙА – площадь метастазов в легких у мышей, получавших йодоацетат в течение 4 сут; ЛИП-ЙА – область метастазов в легких у мышей, получавших липосомальную форму йодоацетата. Данные представлены как среднее ± ос. * р <0.05.

Рис. 3.

Фотографии метастазов в легких на 21-е сутки при кратковременной терапии. (а) – легкие с метастазами у мышей контрольной группы; (б) – метастазы в легкие у мышей, получавших йодоацетат; (в) – липосомы с йодоацетатом. На фото видны легкие с метастазами объемом, близким к среднему.

При курсовом введении в течение 12 сут Лип-ЙА показал колебания ТРО в первичном очаге на уровне 20–40%. Наибольшее отклонение наблюдалось к концу терапии. При этом, несмотря на сложности модели при катетеризации, в том числе ограничения по количеству вводимого препарата, нам удалось получить антиметастатический эффект Лип-ЙА. В группе животных, получавших липосомы с ЙА в течение 12 сут, наблюдалось торможение диссеминации опухолевых клеток в среднем на 51% (рис. 4).

Рис. 4.

Площадь метастазов в легких мышей. Влияние терапии липосомами с йодоацетатом (Лип-ЙА) в течение 12 дней и изображения легких мышей с метастазами карциномы Льюиса (LLC) на фоне терапии. (б) – контрольная группа; (в) – группа с Лип-ЙА терапией в течение 12 дней. Данные представлены как среднее ± ос. * р <0.05.

Таким образом, установлено, что ингибитор гликолиза йодоацетат обладает высокой токсичностью, что в конечном итоге может привести к поражению сердца и других органов, но не оказывает токсического действия на печень. Было показано, что липосомальная форма йодоацетата является более безопасной лекарственной формой. Оценка противоопухолевой активности показала, что влияние обеих форм йодоацетата на рост первичной опухоли было умеренным. Антиметастатический эффект липосомальной формы ингибитора проявляется в условиях длительного приема.