Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 507, № 1, стр. 504-509

В последнее десятилетие активно исследуются особенности биологического действия тяжелых заряженных частиц на организм [1]. Благодаря активному внедрению методов лучевой терапии с использованием высокоэнергетических протонов и ионов углерода были достигнуты значительные успехи в лечении резистентных злокачественных новообразований [2, 3]. Специфика действия тяжелых заряженных частиц позволяет повышать дозы облучения опухоли, значительно увеличивая биологически эффективную дозу, снижая при этом дозу облучения близко расположенных критических органов и здоровых тканей [4]. В последние годы продолжается планирование длительных экспедиций в дальний космос, при которых экипажи будут постоянно подвергаться воздействию галактического космического излучения (ГКИ), в спектре которого преобладают (85–90%) высоко заряженные протоны с энергией 100 МэВ, а также ионы углерода и железа, которые за счет высоких значений линейной передачи энергии (ЛПЭ) обладают высокой биологической эффективностью. Вклад ГКИ на околоземной орбите на высоте 400 км составляет около 50% от суммарной дозы от всех источников космической радиации, а при межпланетных миссиях может достигать 75%. В связи с этим актуальным остается поиск новых радиопротекторов, которые бы защищали здоровые ткани и организмы от генотоксического действия высокоэнергетических частиц, к которым относятся тяжелые ионы, нейтроны и протоны со значениями ЛПЭ > 4 кэВ/мкм. К настоящему моменту известно, что многие радиопротекторы достаточно эффективны при действии фотонных излучений, но не проявляют своих свойств при облучении биологических объектов частицами с высокими значениями ЛПЭ [5]. Это объясняется не только спецификой физического взаимодействия частиц с веществом и распределением дозы в мишени, но и резко различающимися молекулярными механизмами индукции повреждений в клетках, способов их репарации и путями формирования отдаленных эффектов. Современный радиопротектор должен быть нетоксичным, эффективным в широком диапазоне доз при разных режимах введения не только до облучения, но и после; длительно действовать и желательно при неинвазивных методах введения, иметь хорошо изученную динамику распределения в организме. Большинство изученных радиопротекторов оказывают эффективное действие при применении их в субтоксических дозах при внутривенном или внутрибрюшинном введении в короткое время 10–30 мин до облучения и требуют специфических растворителей [6]. В последнее время успешное развитие технологий привело к синтезу наноматериалов, которые используются не только для эффективных систем доставки лекарств и улучшения биологической доступности препаратов, но и открывают возможности поиска новых радиопротекторов, поскольку некоторые наночастицы благодаря своему строению и механизмам действия обладают радиозащитными свойствами [7]. В недавних исследованиях in vitro и in vivo показано, что низкие дозы наночастиц оксида церия (нCeO₂) демонстрируют значительный антиоксидантный потенциал с очень низкой токсичностью [8]. В работе [9] при исследовании in vivo токсичности наночастиц диоксида церия размером 3–5 нм при внутрибрюшинном введении в течение 4 дней концентраций 0.135, 1.35, 13.5 и 135 мг/кг в течение 21 дня не наблюдалось гибели животных и каких-либо побочных эффектов, а при вскрытии животных не обнаружено патологий органов. В этой же работе показано, что введение за 15 мин до облучения наночастиц диоксида церия в концентрации 0.00001 мг/кг в качестве радиопротектора является более эффективным, чем радиозащитный препарат амифостин в дозе 150 мг/кг, который широко применяется в клинической практике. При наблюдении после фракционированного облучения в суммарной дозе 30 Гр за гибелью животных, которые были обработаны наноцерием или амифостином, было обнаружено, что 50% мышей выживали в группе при введении наноцерия к 225 сут, в облученной группе к 132 сут, а половина мышей, обработанные амифостином, погибали уже к 81 сут. Фармакокинетика нCeO₂ в экспериментах на животных достаточно хорошо изучена, хотя публикаций на эту тему среди общего количества работ по биомедицинскому применению препарата немного. При внутривенном введении цитрат-стабилизированный наноцерий (4 нм, 10 мг/кг) в течение 0.5 ч обнаруживается в мозге, сердце, почках, печени и селезенке, затем его концентрация уменьшается или увеличивается в зависимости от органа при наблюдении до 24 ч [10]. Для нCeO₂ показана критическая зависимость распределения и времени выведения в разных тканях организма как от характеристик самого препарата, его дозы, так и способа, и места введения и даже линии животного [10]. В обзоре [11] были суммированы экспериментальные данные по биокинетике нCeO₂, полученные при различных путях воздействия в широком диапазоне доз (6–750 мг/кг) и размеров частиц (3–55 нм), в разных органах и тканях крыс. На основе этих данных была создана модель фармакокинетики при внутривенном введении цитрат-стабилизированного наноцерия с размером частиц 30 нм, которая была калибрована до размера частиц 5 нм, модифицирована и проверена также для ингаляционного, орального, внутривенного и внутритрахеального введения препарата. Авторы отмечают, что модель адекватно описывает кинетику нCeO₂ в различных тканях при внутривенном введении, но с трудностью предсказывает его распределение при других способах введения из-за крайне низких концентраций в тканях ниже порога определения. Было предложено несколько возможных механизмов защитного действия нCeO₂ при воздействии фотонного излучения [12, 13], и, гипотетически, некоторые из этих механизмов могут участвовать и при действии излучений с высокими значениями ЛПЭ.

Мы предположили, что нCeO₂ является перспективным соединением для исследования защиты нормальных клеток in vivo на мышах при действии ускоренных ионов углерода с энергией 400 МэВ/нуклон. Для исследования протекторных свойств нCeO₂ в условиях in vivo были выбраны методы, обладающие высокой генотоксической чувствительностью, отражающие краткосрочные реакции стволовых клеток органов кроветворения и иммунитета при разных уровнях доз облучения: микроядерный тест (МЯ-тест) выявляет реакцию стволовых клеток костного мозга на низкие и средние дозы радиации, которые отражают дозовые нагрузки от ГКИ и при ионной терапии; а также тест на выживаемость животных при облучении в летальных дозах, который характеризует системный ответ тканей и органов организма в отдаленные сроки после облучения.

Эксперименты проводили на 8–9-недельных самцах аутбредных мышей колонии SHK (31–35 г, n = 155), которых разводили и содержали в стандартных условиях вивария ИТЭБ РАН (Пущино, Россия) [14]. Протокол экспериментов был одобрен Комиссией ИТЭБ РАН по биобезопасности и биоэтике (протокол № 26 от 09.02.2021).

В работе использовали водный золь нанокристаллического оксида церия (нCeO₂), стабилизированный цитрат-ионами [15]. Согласно данным электронной микроскопии полученный золь состоял из слабоагрегированных частиц CeO₂ размером 3–4 нм, имеющих форму, близкую к изотропной. Концентрация наночастиц CeO₂ в золе определялась по условиям синтеза и составляла 0.01 М, рН золя нCeO₂ находился в диапазоне 7.2–7.4. На основе наших предыдущих работ по изучению радиозащитного действия наноцерия на клеточных культурах и животных [13] и рекомендаций по особенностям изучения общетоксического действия лекарственных средств и средств медицинского назначения, содержащих наночастицы [16], наноцерий ресуспендировали в физиологическом растворе (ФР) (0.9% раствора NaCl) непосредственно перед введением животным, которым вводили раствор нСеО₂ (10^–6 М) из расчета 8.3 нМ на грамм веса. Использовали несколько схем введения нСеО₂ и ФР: 1) внутрибрюшинная инъекция (в/б) в объеме 0.1 мл за 24 ч до облучения, 2) пероральное введение (per os) в объеме 0.1 мл ежедневно в течение 5 дней до облучения; 3) внутрибрюшинная инъекция (0.1 мл) сразу после облучения.

Облучение ионами углерода осуществлялось моноэнергетическим пучком с энергией на выходе ускорителя 400 МэВ/нуклон на установке “Радиобиологический стенд на углеродном пучке У-70” НИЦ “Курчатовский институт” – ИФВЭ (г. Протвино). Животных облучали тотально в модифицированном пике Брэгга шириной 30 мм в водном фантоме, каждую мышь помещали в хорошо вентилируемый контейнер и попарно располагали в воздушной камере, перпендикулярно направлению пучка. Профили пучка и равномерность поперечного облучения контролировали радиохромной пленкой ЕВТ-3 (GafChromic, США).

Генотоксическое действие нCeO₂ и ионного излучения оценивали в клетках костного мозга мышей (n = 55) по появлению полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ), после облучения в дозе 1.5 Гр. Через 28 ч после облучения мышей эвтанизировали декапитацией и готовили цитологические препараты костного мозга. Время было выбрано с учетом радиационной задержки клеточного деления для фиксации максимального уровня повреждений клеток костного мозга [17]. На каждую экспериментальную точку использовали 5 животных, анализировали не менее 2000 ПХЭ на мышь [16].

Радиозащитный эффект при разных режимах введения нСеО₂ животным определяли после облучения ионами углерода в дозе 6.5 Гр. Мыши были разделены на группы по 10–30 особей. В течение месяца ежедневно регистрировались гибель животных, их вес и количество потребляемой воды и пищи. По итогам наблюдения были определены 30-суточная выживаемость, динамика гибели и средняя продолжительность жизни (СПЖ) погибших мышей.

При статистической обработке результатов по МЯ-тесту вычисляли стандартную ошибку среднего, а сравнение между контрольными и опытными группами проводили по критерию Стьюдента. Показатели выживаемости мышей сравнивали с помощью непараметрических критериев: Гехана-Вилкоксона для оценки продолжительности жизни погибших от облучения животных и логрангового критерия для сравнения 30-суточной выживаемости. Различия считали статистически значимыми при p ≤ 0.05.

В табл. 1 представлена зависимость выхода ПХЭ с МЯ в костном мозге мышей от способов и времени введения нСеО₂ при облучении ионами углерода в дозе 1.5 Гр. С помощью МЯ-теста было выявлено отсутствие генотоксичности наноцерия в выбранной концентрации при однократном внутрибрюшинном и ежедневном введении per os в течение 5 дней. При оценке противолучевой эффективности нCeO₂ было выявлено значительное снижение цитогенетического повреждения во всех вариантах применения как нCeO₂, так и ФР, относительно облученного контроля. Ранее нами было показано, что при внутрибрюшинном и внутривенном введении мышам нCeO₂ также наблюдался радиозащитный эффект при действии рентгеновского излучения в дозе 1.5 Гр, однако ФР за 15 мин или 24 ч до облучения не влиял на величину цитогенетического повреждения в клетках костного мозга [13].

Для оценки эффективности препаратов по критерию фактора изменения дозы (ФИД) использовали дозовую зависимость выхода ПХЭ с МЯ в контроле в диапазоне доз 0–1.5 Гр ионного облучения, для которой был проведен регрессионный анализ: y = 0.4 + 4.9x, где у – % ПХЭ с МЯ; х – доза облучения (Гр) (рис. 1). Значение ФИД получали отношением поглощенной дозы 1.5 Гр к расчетной равноэффективной дозе в контроле (табл. 1).

Рис. 1.

Дозовая зависимость выхода полихроматофильных эритроцитов с микроядрами в костном мозге мышей после облучения ионами углерода в диапазоне 0–1.5 Гр и при различных вариантах введения нСеО2 и ФР при дозе облучения 1.5 Гр: 1 – per os нСеО₂; 2 – per os 0.9% NaCl; 3 – в/б нСеО₂ за 24 ч до облучения; 4 – в/б 0.9% NaCl за 24 ч до облучения; 5 – в/б нСеО₂ сразу после облучения; 6 – в/б 0.9% NaCl сразу после облучения.

Значительный защитный эффект наноцерия (ФИД = 2.59) в отличие от ФР (ФИД = 1.50) наблюдался при пероральном введении в течение 5 сут до облучения, т.е. при длительном профилактическом применении. При количественной оценке радиопротекторных свойств в радиобиологии принято считать, что препарат или способ защиты является эффективным, если величина ФИД больше 1.2. Известно, ФИД наиболее мощных из известных радиопротекторов цистамина и препарата Б-190 составляет величины 1.3–1.5 [18].

Облучение мышей ионами углерода в летальной дозе 6.5 Гр вызывало резкое развитие желудочно-кишечной формы острой лучевой болезни и уже на 3 сут после облучения регистрировали гибель 40% животных контрольной группы при потере веса до 30%, а на 7 сут наблюдали 100% гибель животных.

В период развития острой лучевой болезни во всех группах наблюдались прогрессивное снижение массы тела животных и угнетение двигательной активности. Наиболее резкое изменение веса наблюдалось в экспериментальных группах при введении растворов per os, которое не отличалось от только облученной группы. При введении растворов в/б 30% потеря веса регистрировалась на 8–12 сут после облучения. К 24-м сут масса выживших мышей восстанавливалась и изменения составляли 10–20% от первоначального веса (рис. 2 а). Среди исследованных схем наиболее эффективными оказались инъекции нCeO₂ и ФР, при которых наблюдали защиту от тяжелого течения кишечной формы, и сдвиг основной гибели животных к 10–16 сут в период костномозгового синдрома. При инъекции нCeO₂ и ФР за 24 ч до облучения 30 сут выживаемость составила 31% и 30%, а при инъекции растворов сразу после облучения – 20 и 10% соответственно; при введении растворов per os продолжительность жизни составляла 10 сут и различий в выживаемости животных не было (рис. 2 б). СПЖ погибших мышей в группах, получивших инъекцию растворов, достоверно отличалась от контрольной группы, и для всех групп составила 14 ± 2 сут по сравнению с 6 ± 2 сут в только облученной группе. СПЖ погибших животных при введении растворов per os составило 8 ± 3 сут. Полученные результаты по выживаемости мышей показывают отсутствие защитного действия нCeO₂ на фоне ФР: оба раствора при инъекциях за 24 ч до или сразу после облучения приводили к значительному снижению гибели животных и изменению динамики течения острой лучевой болезни за счет смягчения повреждений желудочно-кишечного тракта.

Рис. 2.

Изменение массы тела (а) и динамика гибели (б) мышей после тотального облучения ионами углерода в дозе 6.5 Гр при различных вариантах введения нCeO₂ и ФР.

Таким образом, полученные результаты показали, что введение нCeO₂ мышам per os до облучения ионами углерода в терапевтической дозе 1.5 Гр значительно снижает уровень цитогенетических повреждений в наиболее чувствительных клетках костного мозга, что свидетельствует о высокой радиозащитной эффективности профилактического применения нCeO₂ при неинвазивном способе введения. В отличие от результатов МЯ-теста данные по выживаемости мышей показывают отсутствие защитного действия нCeO₂ при пероральном введении. При инъекциях как нСеО₂, так и ФР, за 24 ч до или сразу после облучения радиопротекторный эффект был выявлен обоими тестами. Данные показали зависимость биологических эффектов нCeO₂ от длительности и способа введения, влияния растворителя, а также уровня доз облучения и качества излучения. Следует отметить, что в нашей работе с использованием ионов углерода выявлен радиозащитный эффект ФР при некоторых режимах введения, в отличие от данных [10] на мышах при внутривенном введении ФР за 15 мин до или после облучения рентгеновскими лучами. В ряде работ исследователи указывали на существенное влияние ФР на различные биологические эффекты [19], а также режима и способа введения нCeO₂, типа тканей и даже линии животных при исследовании воздействий, приводящих к острому окислительному стрессу [10]. В связи с этим актуальной остается проблема подбора адекватных методов и животных моделей для доклинических исследований наноматериалов в условиях in vivo [16, 20]. Полученные данные демонстрируют принципиальную возможность использования препаратов наноцерия для защиты от действия низких и высоких доз излучений с высокими значениями ЛПЭ и перспективность дальнейших исследований новых наноматериалов и способов их введения.