Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 507, № 1, стр. 520-524

Нарушение транспорта липидов играет важную роль в механизме повреждения стенки сосудов при атеросклерозе и сахарном диабете [1]. Липид-транспортирующая система организма представлена двумя основными классами липид-белковых наноструктур плазмы крови – липопротеиды низкой плотности (ЛНП) и липопротеиды высокой плотности (ЛВП), которые существенно различаются по метаболическим функциям, а также по размеру и химическому составу частиц. Частицы ЛВП содержат апопротеины А₁, С₂ и Е, тогда как частицы меньших по размеру ЛНП содержат единственный белок – апоВ-100. Образующиеся в печени ЛНП транспортируют липиды в периферические ткани, а ЛВП осуществляют обратный транспорт липидов для их утилизации в печени. Апопротеин В-100 частиц ЛНП может подвергаться химической модификации с участием низкомолекулярных дикарбонилов, образующихся при свободнорадикальном окислении полиеновых липидов (таких как 4-гидроксиноненаль и малоновый диальдегид) и при ферментативном окислении или автоокислении глюкозы и других 6 атомных углеводов соответственно (таких как глиоксаль и метилглиоксаль) [1]. Частицы окислительно модифицированных ЛНП активно захватываются scavenger-рецепторами клеток сосудистой стенки, что сопровождается возникновением предатерогенных повреждений сосудов при атеросклерозе и диабете [2]. Кроме того показано, что частицы окисленных ЛНП могут образовывать комплекс с рецептором LOX-1 эндотелиоцитов, стимулируя запуск апоптоза, приводящий к дисфункции эндотелия [3]. Таким образом очевидно, что окислительные превращения липопротеидов могут играть ведущую роль в молекулярных механизмах развития атеросклероза и сахарного диабета [1, 4]. Тем не менее в литературе не существует общего мнения относительно сравнительной окисляемости частиц ЛНП и ЛВП [5–7], поскольку при сравнении скорости окисления обычно используют не только различные (зачастую некорректные) методы анализа, но и производят расчеты на количество белка, что при большой разнице в содержании апопротеинов в частицах ЛНП и ЛВП существенно искажает результаты и не позволяет сделать однозначных выводов. Было показано, что частицы ЛВП могут не только ингибировать окисление ЛНП при совместной инкубации этих частиц in vitro [8], но и осуществлять “антиоксидантный” эффект in vivo, подавляя окисление ЛНП в кровотоке [9, 10]. Кроме того, была высказана гипотеза о том, что частицы ЛНП способны аккумулировать окисленные фосфолипиды с надмолекулярных липид-белковых комплексов (липопротеидов и биомембран) и транспортировать их в печень для ферментативной детоксикации липопероксидов [10]. К сожалению, эта гипотеза не была подтверждена экспериментально с использованием адекватных подходов и методов, позволяющих получить неопровержимые результаты. Исходя из вышесказанного, в настоящей работе исследовали потенциальную способность частиц ЛНП и ЛВП к свободнорадикальному перекисному окислению, а также способность этих липопротеидов абсорбировать гидроперокси-производные фосфолипидов с поверхности окисленных биомембран.

Препаративное выделение ЛНП и ЛВП проводили методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности NaBr на ультрацентрифуге Beckman Optima XPN-80 (США) с использованием ротора Ti-60 [11]. После диализа содержание белка в образцах липопротеидов определяли по методу Лоури, а затем пробы разбавляли до 50 мкг белка/мл раствором, содержащим 0.154 М NaCl в 50 мМ K,Na-фосфатном буфере рН 7.4 и окисление частиц ЛНП и ЛВП при 37°С индуцировали введением в среду инкубации 30 мкМ CuSO₄, после чего через фиксированные интервалы времени измеряли накопление липогидропероксидов (LOOH) при 233 нм на спектрофотометре UV-2600 Shimadzu (Япония) [4]. Содержание липогидропероксидов (конъюгированные диены – ∆D₂₃₃) в частицах ЛНП и ЛВП рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинции 22 000 моль^–1 см^–1 для LOOH и исходя из содержания апопротеинов В-100 и А₁, измеренных на анализаторе Abbott Architect C8000 (США) при использовании тест-наборов этой же фирмы.

Для выделения митохондрий печень крыс (самцы линии WKY, 250–300 г) перфузировали охлажденным изотоническим раствором KCl и гомогенизировали (1:10 вес/объем) в гомогенизаторе Поттера с тефлововым пестиком в 0.25 М растворе сахарозы, содержащем 10 мM МОРS и 1 мМ ЭДТА [12]. Ядра и дебрис осаждали при 700 g в течение 10 мин в рефрижераторной центрифуге Eppendorf 5804R (Германия) и супернатант подвергали повторному центрифугированию при 8000 g в течение 10 мин для осаждения “тяжелых” митохондрий. Осадок ресуспендировали в среде выделения без ЭДТА и дважды переосаждали митохондрии, после чего органеллы вновь ресуспендировали в изотоническом K,Na-фосфатном буфере рН 7.4 (1 мг белка/мл) и свободнорадикальное окисление полиеновых фосфолипидов митохондриальных мембран индуцировали внесением 0.5 мМ аскорбата для восстановления эндогенного железа. Кинетику свободнорадикального окисления митохондрий в аэробных условиях измеряли при 233 нм на спектрофотометре UV-2600 Shimadzu (Япония) c интегрирующей сферой ISR-2600, позволяющей проводить анализы в мутных средах. После 4-часовой инкубации (достижение плато на кинетической кривой) окисление митохондрий ингибировали внесением 1 мМ ЭДТА. Осадок окисленных митохондрий (8 мкмоль LOOH/мг белка) ресуспендировали в среде инкубации без аскорбата, содержащей 1 мМ ЭДТА, дважды переосаждали при 8000 g в течение 10 мин и осадок вновь ресуспендировали (1 мг белка/мл) в изотоническом K,Na-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 1 мМ ЭДТА. После  этого в среду вносили ЛНП или ЛВП (200 мкг белка/мл) и проводили инкубацию в течение 6 ч. Через определенные интервалы времени отбирали аликвоты инкубационной среды, центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин для осаждения митохондрий и фрагментов их мембран, а затем в супернатанте, содержащем только частицы липопротеидов, измеряли поглощение конъюгированных диенов при 233 нм.

Результаты исследования сравнительной кинетики окисляемости частиц ЛНП и ЛВП представлены на рис. 1. Как видно из рис. 1, при расчете на 1 частицу скорость свободнорадикального окисления частиц ЛНП in vitro в идентичных условиях более чем на два порядка превышает скорость окисления частиц ЛВП.

Рис. 1.

Сравнительная кинетика свободнорадикального Cu²⁺-индуцируемого окисления ЛНП (кривая 1) и ЛВП (кривая 2) при расчете на одну частицу.

Из полученных данных следует, что частицы ЛНП и в условиях in vitro должны быть значительно более чувствительны к индукции свободнорадикального окисления в наружном фосфолипидном слое, чем частицы ЛВП. Следует отметить, что исходное содержание липогидропероксидов (ацилгидроперокси-производных фосфолипидов) в изолированных ЛНП составляло 4.2 ± ± 0.11 пикомоль × 10^–11 LOOH на частицу, тогда как исходное содержание первичных продуктов свободнорадикального окисления в ЛВП составляло 0.20 ± 0.04 пикомоль × 10^–11 LOOH на частицу. Таким образом, исходная окисленность частиц ЛНП in vivo также была на порядок выше окисленности частиц ЛВП. Из этого следует, что скорость свободнорадикального окисления в частицах ЛНП in vivo должна быть на порядок выше, чем скорость окисления в частицах ЛВП, поскольку при деструкции липогидропероксидов (LOOH) из них образуются алкоксильные свободные радикалы (LО^•), способные инициировать дальнейшее свободнорадикальное окисление липидного субстрата по цепному механизму. Поскольку повышенная чувствительность частиц ЛНП к индукции в них свободнорадикального окисления (susceptibility to oxidation) определяется, преимущественно, особенностями структуры этих частиц, можно полагать, что и в условиях in vivo при инициации окисления активными формами кислорода (АФК) в процессе развития окислительного стресса частицы ЛНП будут подвергаться свободнорадикальному окислению в значительно большей степени, чем частицы ЛВП.

Результаты исследования возможности переноса ацилгидроперокси-производных фосфолипидов с окисленных биомембран на частицы ЛНП и ЛВП представлены на рис. 2.

Рис. 2.

Кинетика встраивания гидроперокси-производных фосфолипидов из подвергнутых свободнорадикальному окислению мембран митохондрий печени крысы в частицы ЛНП (кривая 1) и ЛВП (кривая 2). Условия эксперимента описаны при изложении методов исследования.

Полученные данные свидетельствуют о том, что нативные частицы ЛНП при совместной инкубации с окисленными митохондриями могут активно захватывать ацилгидроперокси-производные фосфолипидов, тогда как скорость дрейфа окисленных фосфолипидов с биомембран на частицы ЛВП весьма незначительна (рис. 2, кривые 1 и 2).Таким образом, высказанная ранее гипотеза о возможности обратного транспорта окисленных липидов частицами ЛВП в печень [10] в наших экспериментах подтверждения не получила. Следует отметить, что принципиальная возможность переноса ацилгидроперокси-производных фосфолипидов с окисленных мембран (“теней” эритроцитов) в ЛНП при совместной инкубации этих биоструктур была продемонстрирована ранее [13] и не представляется чем-то необычным. Важно другое – что именно частицы ЛНП способны не только легко подвергаться эффективному свободнорадикальному окислению, но и активно захватывать окисленные фосфолипиды с других липид-белковых надмолекулярных комплексов при взаимодействии с ними. Обогащенные гидроперокси-производными фосфолипидов частицы ЛНП подвергаются модификации вторичными продуктами деструкции липогидропероксидов – α, oxo-альдегидами, такими как окси- и гидроксиноненали и малоновый диальдегид [14], причем карбонильная модификация апопротеина В-100 частиц ЛНП, вероятно, играет ключевую роль в пусковых механизмах атерогенеза [1] и сахарного диабета [1, 3, 4]. Полученные нами данные свидетельствуют о существовании различных механизмов, приводящих к обогащению “атерогенных” частиц ЛНП первичными и, как следствие этого, вторичными продуктами свободнорадикального окисления, что в конечном итоге лишний раз подтверждает опасность патогенетически важной окислительной трансформации этих частиц in vivo [1–3], тогда как “антиоксидантная” функция ЛВП [15] остается не доказанной. Результаты наших исследований свидетельствуют о необходимости медикаментозных мероприятий, направленных на снижение окисленности частиц ЛНП для подавления молекулярных механизмов повреждения стенки сосудов при атеросклерозе и сахарном диабете.