Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 508, № 1, стр. 9-13

ВВЕДЕНИЕ

Каротиноиды являются вторичными метаболитами и объединяют более 700 соединений с разнообразными биологическими функциями, касающимися взаимодействия организма с окружающей средой [1]. Их возникновение связывают с археями и бактериями, где каротиноиды играют роль стабилизаторов клеточных мембран [1].

У растений синтез каротиноидов происходит во всех тканях. Высокий восстановительный потенциал данных соединений, связанный с линейной системой сопряженных двойных связей С=С, делает их сильными антиоксидантами и участниками стрессового ответа. В фотосинтезирующей ткани они вносят значимый вклад в защиту фотосинтетического аппарата. В запасающих тканях каротиноиды определяют пигментацию, что важно с точки зрения опыления (цветки) и распространения семян (плоды) [1–4].

Биосинтез каротиноидов начинается с образования 15-цис-фитоина, который в несколько этапов преобразуется в полностью-транс-ликопин, являющийся субстратом для двух метаболических потоков β–β и β–ɛ с образованием полностью-транс-α-,β-каротинов и ксантофиллов. Цепочка реакций сопровождается цис-транс-изомерией системы сопряженных двойных связей. Так, цис-ликопин преобразуется в транс-ликопин под воздействием каротиноид-цис-транс-изомеразы CrtISO [5, 6].

Ген CrtISO (Solyc10g081650) идентифицирован в геноме томата Solanum lycopersicum L. при анализе мутации tangerine, при которой красная окраска спелого плода становится оранжевой [7]. Позднее в геноме томата найдены еще два гомолога CrtISO, аннотированные как CrtISO-like 1 (CrtISO-L1; Solyc05g010180.2) и CrtISO-L2 (Solyc07g021640) [2, 3].

S. lycopersicum входит в секцию Lycopersicon, состоящую из 12 видов томата, окраска спелого плода которых ассоциирована с эволюционным возрастом – от зеленой (древние виды) до желто-оранжево-красной (молодые виды). Поэтому виды томата являются удачной моделью для изучения каротиногенеза [8].

Целью данного исследования стала характеристика генов CrtISO, CrtISO-L1 и CrtISO-L2 у дикорастущих видов томата S. habrochaites (LA2144, зеленоплодный), S. cheesmaniae (LA0421, желтоплодный) и S. pimpinellifolium (LA0480, красноплодный) в сравнении с культивируемым видом S. lycopersicum (сорт Heinz, красноплодный).

Последовательности генов были найдены по гомологии с CrtISO, CrtISO-L1 и CrtISO-L2 S. lycopersicum в геномах видов (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), за исключением S. cheesmaniae, и сравнены. Было обнаружено, что белки CrtISO содержат домен TIGR02730 (98-592 ак), характерный для каротин-изомераз, тогда как CrtISO-L1 и CrtISO-L2 – домен COG1233, специфичный для суперсемейства фитоин-дегидрогеназ. Однако все три типа последовательностей аннотированы как каротиноид-изомеразы – гомологи бактериальной фитоин-десатуразы CRTI, совмещающей функции десатурации и изомеризации [5, 9].

Предположительно сходная функция CrtISO, CrtISO-L1 и CrtISO-L2 в сочетании с низким сходством между ними (23–32%) может указывать их происхождение в результате давних дупликаций гена-предшественника. Филогенетический анализ, распределивший ортологи по трем кладам, показал, что клада CrtISO-L2 занимает базовое положение по отношению к сестринским кладам CrtISO и CrtISO-L1 (рис. 1). Это может свидетельствовать о более древнем происхождении CrtISO-L2, а также о сходстве функций CrtISO и CrtISO-L1. Наличие всех трех гомологов у Arabidopsis thaliana L. (рис. 1) позволяет предположить, что их возникновение предшествует расхождению высших растений на астериды и розиды.

Рис. 1.

Дендрограмма на основе аминокислотных последовательностей CrtISO, CrtISO-L1 и CrtISO-L2 S. lycopersicum (cv. Heinz), S. pimpinellifolium (LA0480), S. pennellii (LA0716), S. habrochaites (LA2144), A. thaliana и Brassica napus. Рядом с названиями белков – NCBI ID. Построено в MEGA 7.0 (https://www.megasoftware.net/; метод Maximum Likelihood; 1000 бутстреп-реплик).

Для уточнения функции CrtISO, CrtISO-L1 и CrtISO-L2 было определено содержание каротиноидов и профиль экспрессии генов в листьях и спелых плодах S. habrochaites, S. cheesmaniae, S. pimpinellifolium и S. lycopersicum.

Биохимический анализ показал отсутствие между образцами различий по сумме каротиноидов в листьях; в плодах их содержание было выше в 20–30 раз у красноплодных видов в сравнении с S. cheesmaniae и S. habrochaites. β-каротин в сходных количествах накапливали все плоды, а транс-ликопин – только красные (рис. 2).

Рис. 2.

Содержание (мг/г сырого веса) каротиноидов в листе (сумма каротиноидов) и спелом плоде (сумма каротиноидов, ликопин, β-каротин) S. lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. cheesmaniae и S. habrochaites (окраска спелого плода обозначена цветным кругом рядом с названием). Измерения проводили согласно [6].

Известно, что плод S. lycopersicum меняет окраску по мере созревания за счет того, что хлоропласты преобразуются в хромопласты, способные накапливать каротиноиды [10, 11]. Различная окраска плодов S. cheesmaniae и S. habrochaites при равном количестве β-каротина (рис. 2) может быть следствием нарушений в процессе формирования хромопластов у S. habrochaites, что было показано ранее [12]. С учетом сказанного, сходная сумма каротиноидов в листьях образцов предполагает, что эволюция каротиногенеза у видов томата затронула только запасающие ткани, причем, в регуляции, скорее, идентичности пластид, чем пути биосинтеза каротиноидов.

Экспрессионный анализ обнаружил транскрипты трех генов в листьях и спелых плодах всех образцов. В плодах уровень транскриптов CrtISO-L1 и CrtISO-L2 был крайне низок (кроме высокого уровня CrtISO-L2 у S. lycopersicum) в сравнении с CrtISO, который наиболее высоко экспрессировался у S. cheesmaniae (в ~1.8, 7.5 и 45 раз выше, чем у S. lycopersicum, S. pimpinellifolium и S. habrochaites, соответственно) (рис. 3). Более высокий уровень транскриптов CrtISO по сравнению с CrtISO-L1 и CrtISO-L2 (рис. 3) согласуется с профилем экспрессии ортологичных генов у Citrus sinensis [13], что подтверждает роль CrtISO в каротиногенезе как в листьях, так и в плодах. Значительно большее количество транс-криптов CrtISO-L1 и CrtISO-L2 в листьях по сравнению с плодами (рис. 3) предполагает преимущественное участие этих генов в биосинтезе каротиноидов в фотосинтезирующей ткани.

Рис. 3.

Профиль экспрессии генов CrtISO, CrtISO-L1 и CrtISO-L2 и его корреляция с содержанием каротиноидов в листе и спелом плоде S. lycopersicum, S. pimpinellifolium, S. cheesmaniae и S. habrochaites (окраска спелого плода обозначена цветным кругом рядом с названием). Количественную РВ-ПЦР проводили согласно [6]. Праймеры, специфичные для CrtISO, CrtISO-L1, CrtISO-L2 и референсных генов Expressed и ACTIN2, использованы согласно [5, 6]. Результаты РВ-ПЦР и линейную регрессию оценивали в статистической программе Graph Pad Prism v. 8 (GraphPad Software Inc., США) на основе двух биологических и трех технических повторов (p-value <0.05 для значимых различий в экспрессии гена между одним типом ткани разных образцов; R² > 0.7 для существенной корреляции).

Оценка зависимости содержания каротиноидов от уровня экспрессии генов CrtISO, CrtISO-L1 и CrtISO-L2 не выявила такой взаимосвязи в спелом плоде (рис. 3), что было ранее продемонстрировано для CrtISO на выборке красноплодных сортов томата [6]. Однако в листьях были обнаружены положительные корреляции “сумма каротиноидов – уровень транскриптов CrtISO-L1/ CrtISO-L2” (рис. 3).

Ранее на основании экспериментов по замалчиванию генов CrtISO, CrtISO-L1 и CrtISO-L2 томата было предположено участие CrtISO-L1 и CrtISO-L2 в биосинтезе полностью-транс-ζ-каротина – пути, конкурентном по отношению к синтезу полностью-транс-ликопина, с образованием неизвестных изопреноидов [5, 14]. Прямая зависимость суммы каротиноидов в листьях от уровня экспрессии CrtISO-L1 и CrtISO-L2 (рис. 3) может свидетельствовать в пользу данного предположения.

Таким образом, у анализируемых видов томата содержание каротиноидов в спелом плоде соответствует его окраске, и равное содержание каротиноидов в листьях предполагает сходную скорость фотосинтеза. Ген CrtISO играет определяющую роль в биосинтезе каротиноидов как в плодах, так и в листьях. Гены CrtISO-L1 и CrtISO-L2 могут определять сдвиг биосинтеза каротиноидов в сторону полностью-транс-ζ-каротина и терпеноидов, являющихся промежуточными продуктами в биосинтезе различных жировых соединений, и, таким образом, сохраняют раннюю функцию каротиноид-изомераз в синтезе каротиноидов для клеточных мембран.