Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 508, № 1, стр. 91-94

Kaiso – транскрипционный фактор позвоночных, специфично связывающий метилированные CpG последовательности ДНК при помощи цинковых пальцев C2H2-типа. Помимо C2H2-доменов, на N-конце Kaiso находится димеризующийся BTB/POZ домен (BTB-домен). Ряд данных свидетельствует, что Kaiso является репрессором транскрипции [1]. В предыдущих работах было показано взаимодействие Kaiso и ко-репрессора NCoR, что объясняет, каким образом данный фактор участвует в репрессии транскрипции [2]. Транскрипционный ко-репрессор NCoR является компонентом мультибелковых репрессорных комплексов, которые включают гистон-деацетилазы (HDAC) классов 1 и 2 и другие вспомогательные белки. NCoR содержит несколько доменов (рис. 2б), которые отвечают за белок-белковые взаимодействия и является ключевым звеном в процессах сборки и привлечения репрессорных комплексов, одновременно взаимодействуя с субъединицами данных комплексов, транскрипционными факторами, а также с гистонами [3, 4]. Кроме того, NCoR непосредственно регулирует активность HDAC3 [5]. Первоначально NCoR был идентифицирован как белок, репрессирующий транскрипцию генов-мишеней рецепторов тиреоидного гормона и ретиноевой кислоты [6]. Нарушения экспрессии NCoR связывают с развитием некоторых онкологических заболеваний, например, глиобластомы [7].

Рис. 1.

Исследование способности делеционных мутантов белка Kaiso, слитых с AD Gal4, к взаимодействию с фрагментами белка NCoR, слитых с BD Gal4, в дрожжевой двугибридной системе. AD – активационный домен белка GAL4. BD – ДНК-связывающий домен GAL4. На схеме белков исследованный участок обозначен толстой линией, а ниже указаны номера аминокислот в полипептидной последовательности. В таблице + и – обозначают наличие или отсутствие взаимодействия между соответствующими белками. Пропуски в таблице означают отсутствие экспериментальных данных. В качестве положительного контроля использовалась способность к гомодимеризации N-конца белка Kaiso (1–117 а.к.), содержащего BTB-домен, а в качестве отрицательного контроля – тестирование всех исследуемых белков на наличие взаимодействия только с активационным (AD) или ДНК-связывающим (BD) доменом белка GAL4. C2H2 – домены цинковых пальцев C2H2-типа, BTB - Broad-complex, tramtrack, and bric-a-brac domain.

Рис. 2.

а – Взаимодействие полноразмерного Kaiso, а также его некоторых делеционных производных в ДДС. Экспериментальные чашки, не содержащие гистидина, показаны слева, итоговая таблица взаимодействий справа. б – Схематичное изображение районов взаимодействия NCoR с белками Kaiso и BCL6. RD – репрессионные домены NCoR, NRID – домены, связывающие ядерные рецепторы, DAD – deacetylase activating domain, HID – histone interaction domain, BBD – BCL6-binding domain. Прочие условные обозначения аналогичны рис. 1. Номера аминокислотных остатков, обозначающих границы доменов и взаимодействующих участков у NCoR, указаны сверху, а у Kaiso и BCL6 снизу. Участки взаимодействия белков обозначены пунктирными линиями.

Ряд транскрипционных факторов, включая BTB-содержащие белки BCL6, MAZR, PLZF, а также Kaiso, взаимодействуют с NCoR и могут привлекать репрессорные комплексы в область целевых промоторов, инициируя репрессию транскрипции. В связывании с NCoR участвуют BTB-домены транскрипционных факторов [2, 8–10]. Кристаллические структуры комплексов BTB-домена BCL6 и фрагментов NCoR, а также его ближайшего гомолога SMRT(NCoR2) показали, что во взаимодействии принимает участие пептид-связывающая бороздка BTB-домена и консервативная BBD1 полипептидная последовательность в С-концевой части ко-репрессоров [8, 11]. Также у NCoR описана дополнительная С-концевая последовательность BBD2, стабилизирующая взаимодействие с BCL6 [11].

Ранее методом GST pull-down было показано, что полноразмерный белок Kaiso связывается с N-концевым RD1-доменом NCoR, что отличается от механизма связывания данного ко-репрессора с BCL6. Также было показано, что BTB-домен Kaiso связывается с полноразмерным NCoR [2]. Методом дрожжевой двугибридной системы (ДДС) нам не удалось подтвердить прямое взаимодействие BTB-домена Kaiso и RD1-домена NCoR. Таким образом, целью настоящего исследования стало картирование доменов, определяющих взаимодействие между белками Kaiso и NCoR.

Для картирования участка взаимодействия на основе опубликованных структурных данных, а также модели Alphafold2, была проанализирована доменная организация Kaiso, включающая BTB-домен и три ДНК-связывающих цинковых пальца, между которыми расположен длинный неструктурированный участок [12, 13]. За последним цинковым пальцем следует консервативная последовательность, принимающая участие в стабилизации ДНК-белкового комплекса, после которой располагается неструктурированный C-концевой участок. Исходя из доменной организации, был получен ряд делеционных мутантов Kaiso: BTB-домен (1–117 а.о.), белок без BTB-домена (119–672 а.о.), цинковые пальцы (472–579 а.о.), С-концевой участок (596–672 а.о.), а также несколько вариантов белка с усеченным C-концом (рис. 1). Исследование белок-белковых взаимодействий проводилось методом ДДС. Были получены генетические конструкции для экспрессии делеционных производных Kaiso и NCoR, слитых с активационным (AD) или с ДНК-связывающим (BD) доменом транскрипционного активатора GAL4. Эксперименты с полноразмерным Kaiso, слитым с BD GAL4, ограничиваются его способностью к сильной активации транскрипции в ДДС, что позволяет исследовать его взаимодействия с другими белками только в случае, если он слит с активационным доменом GAL4.

По результатам ДДС было подтверждено прямое взаимодействие между полноразмерным белком Kaiso(full) и RD1-доменом NCoR(1-373). При этом Kaiso не взаимодействует с NCoR(1-146), что говорит о расположении области, связывающейся с Kaiso, между 146 и 373 аминокислотными остатками NCoR. Прямое взаимодействие изолированного BTB-домена Kaiso и NCoR(1-373) подтверждено не было. Также не было выявлено взаимодействие NCoR(1-373) с любым вариантом Kaiso с усеченным C-концом, не содержащим цинковые пальцы (рис. 1). При этом было показано взаимодействие NCoR(1-373) с производными Kaiso(1-579) и Kaiso(1-604), что указывает на то, что в связывании с ко-репрессором принимают участие C2H2 цинковые пальцы Kaiso (рис. 2а).

Интересно, что при взаимодействии ко-репрессора с Kaiso(1-579) рост дрожжей происходит значительно быстрее, чем в случае с Kaiso(1-604). Данный эффект может быть обусловлен тем, что во взаимодействии с ко-репрессором принимает участие второй β-тяж третьего цинкового пальца Kaiso, с которым, исходя из структурных данных, взаимодействует β-тяж из участка 579–604 а.о. и конкурирует с ним за связывание с NCoR. Отсутствие прямого взаимодействия NCoR с изолированными цинковыми пальцами Kaiso, а также с Kaiso(119-672) можно объяснить необходимостью димеризации Kaiso для эффективного связывания ко-репрессора. Также нельзя исключать вероятного нарушения сворачивания белков при удалении их N-концевых фрагментов, что иногда наблюдается в ДДС.

Полученные результаты свидетельствуют, что механизм взаимодействия NCoR с BTB-содержащим белком Kaiso принципиально отличается от описанного ранее взаимодействия с BCL6, в случае которого с N-концевым BTB-доменом BCL6 связывается консервативный C-концевой участок ко-репрессора (рис. 2б). В отличие от BCL6, в описанном нами взаимодействии N-концевой район NCoR(146-373) связывается с C-концевыми C2H2 цинковыми пальцами Kaiso. При этом в данном взаимодействии не принимает участие BTB-домен Kaiso, однако в предыдущей работе [2] методом GST pull-down показано, что BTB-домен Kaiso взаимодействует с полноразмерным NCoR. Вероятно, BTB-домен Kaiso также имеет низкоаффинные сайты связывания в C-концевой области NCoR, детектируемые при высоких концентрациях белка в in vitro системе.

Таким образом, NCoR может одновременно взаимодействовать с белками BCL6 и Kaiso, что может увеличивать эффективность рекрутирования NCoR-зависимых репрессорных комплексов на регуляторные элементы, связанные с Kaiso и BCL6. В целом полученные нами данные свидетельствуют о том, что NCoR может использовать различные домены для взаимодействия с транскрипционными факторами, что, вероятно, определяет широкий спектр потенциальных ДНК-связывающих транскрипционных факторов-партнеров NCoR-зависимых репрессорных комплексов.