Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 508, № 1, стр. 30-34

Разработка эффективных стратегий для контролируемой индукции овуляции, в том числе при вспомогательных репродуктивных технологиях, является актуальной задачей современной эндокринологии и репродуктивной медицины. В настоящее время для этого используют препараты гонадотропинов – мочевого и рекомбинантного хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и рекомбинантного лютеинизирующего гормона (ЛГ), но они применяются в сравнительно высоких дозах, и это приводит к гиперактивации овариального рецептора ЛГ/ХГЧ и усиливает экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), что может стать причиной синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) [1]. Наряду с этим, гонадотропины обладают низкой специфичностью по отношению к внутриклеточным каскадам в клетках-мишенях, что обусловлено взаимодействием активированного гормоном рецептора ЛГ/ХГЧ с различными типами гетеротримерных G-белков (G_s, G_q/11) и β-аррестинов [2, 3]. Многие побочные эффекты фармакологических препаратов ЛГ и ХГЧ обусловлены тем, что паттерн их N-гликозилирования отличается от такового у природных гормонов [4]. Важно отметить, что N-гликозилирование не только влияет на аффинность гонадотропинов к рецептору, но и играет определяющую роль в их эффекторной специфичности [3, 4].

Все вышесказанное требует разработки альтернативных подходов для индукции овуляции, и большие ожидания здесь связывают с аллостерическими регуляторами рецептора ЛГ/ХГЧ, в том числе с производными тиено[2,3-d]-пиримидина [5, 6]. Нами ранее были разработаны и изучены два тиено[2,3-d]-пиримидиновых производных TP03 и TP04, наделенные свойствами полных аллостерических агонистов рецептора ЛГ/ХГЧ, которые при введении самцам крыс с андрогенным дефицитом, вызванным старением или сахарным диабетом, восстанавливали тестикулярный стероидогенез, нормализовали уровень тестостерона, улучшали сперматогенез [7, 8]. Мы предположили, что эти соединения при введении самкам крыс могут выступать в качестве индукторов овуляции, стимулируя овариальный стероидогенез. В пользу этого свидетельствуют данные о том, что соединение Org43553, наделенное активностью агониста рецептора ЛГ/ХГЧ и также относящееся к классу тиено[2,3-d]-пиримидинов, способно индуцировать овуляцию у животных и в условиях клиники у женщин-добровольцев [9, 10]. В соответствии с этим, целью работы было в сравнительном аспекте исследовать способность ХГЧ и TP03 индуцировать овуляцию у неполовозрелых самок крыс, регулировать овариальный стероидогенез и влиять на экспрессию генов VegfA и VegfB, кодирующих различные изоформы фактора роста эндотелия сосудов (VEGF-A, VEGF-B), вовлеченные в развитие СГЯ [11]. При этом оценивалась временная динамика изучаемых эффектов TP03 и ХГЧ.

В опытах использовали неполовозрелых самок крыс линии Wistar возраста 22–24 дня, эксперименты осуществляли в соответствии с требованиями Этического комитета ИЭФБ РАН (протокол № 2/4-2021), European Communities Council Directive 1986 (86/609/EEC) и “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”. Для стимуляции фолликулогенеза использовали гонадотропин сыворотки жеребых кобыл Фоллимаг (1000 МЕ/флакон, “Мосагроген”, Россия) (п/к, 15 МЕ/крысу). Спустя 48 ч после обработки Фоллимагом крысам вводили индукторы овуляции – TP03 (в/б, 50 мг/кг) или ХГЧ (п/к, 15 МЕ/крысу). После введения TP03 или ХГЧ через 4, 8, 16 или 24 ч у животных забирали влагалищные мазки для микроскопии. До и через соответствующие временные интервалы после введения индукторов овуляции крыс анестезировали (хлоральгидрат, 400 мг/кг, в/б), декапитировали, забирали и взвешивали яичники, морфологически оценивали число созревших фолликулов, измеряли экспрессию овариальных генов. Из шейных вен забирали кровь для определения стероидных гормонов. Формировали 10 групп (во всех n = 5): контрольные крысы (К), получавшие вместо препаратов их растворители; крысы, которых обрабатывали только Фоллимагом (через 48 ч после инъекции) (Ф); крысы, которых через 48 ч после инъекции Фоллимага обрабатывали TP03 (в/б, 50 мг/кг) или ХГЧ (п/к, 15 МЕ/крысу) и декапитировали через 4, 8, 16 и 24 ч после введения TP03 (ФТ-4, ФТ-8, ФТ-16, ФТ-24) или ХГЧ (ФГ-4, ФГ-8, ФГ-16, ФГ-24).

Для морфологического анализа яичники в течение 48 ч (+4°C) фиксировали в 4%-ном растворе пара-формальдегида, который готовили в фосфатном буфере (0.1 М, pH 7.2), содержащем 0.9% NaCl (PBS). После промывки в PBS образцы помещали в 30%-ный раствор сахарозы в PBS (+4°C) и после криопротекции замораживали на сухом льду в среде Tissue-Tek® (“Sacura, FinetekEurope”, Нидерланды). Продольные срезы яичника (10 мкм) получали с помощью криостата Leiсa CM-1520 (“Leica Microsystems”, Германия), каждый десятый из них монтировали на стекла Super-Frost/plus (“Menzel”, Германия) и высушивали. После обработки 50%-ным раствором этанола (15 мин) стекла окрашивали Sudan-3 (15 мин), затем докрашивали гематоксилином и заключали под покровное стекло с глицерином. Изображения анализировали с помощью микроскопа Carl Zeiss Imager A1 (“Carl Zeiss”, Германия) с видеокамерой Axiocam 712 и программным обеспечением Zen 3.4. Согласно гистологическому атласу [12], на срезах подсчитывали количество предовуляторных фолликулов и желтых тел, по которым оценивали число фолликулов, подвергнувшихся овуляции. Уровни эстрадиола и прогестерона в крови крыс определяли с помощью ИФА-анализа, используя наборы “Эстрадиол-ИФА” и “Прогестерон-ИФА” (“ХЕМА”, Россия). Тотальную РНК из яичников выделяли с помощью реагента ExtractRNA (“Евроген”, Россия), и проводили обратную транскрипцию с помощью набора “MMLV RT Kit” (“Евроген”, Россия). ПЦР осуществляли на амплификаторе Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR System (“Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.”, США) в смеси, содержащей 0.4 мкМ прямо-го и  обратного праймеров, используя реагент qPCR-HS SYBR+Low ROX (“Евроген”, Россия). Экспрессию генов VegfA и VegfB оценивали с помощью метода delta-delta-C_t, используя ген актина B (Actb) в качестве референсного, как описано ранее [7]. Статистический анализ проводили с помощью программы “Microsoft Office Excel 2007” (США). Результаты представляли, как M ± SEM. Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка. Значимыми считали различия при p < 0.05.

Исследование удельной массы яичников показало значимое ее повышение во всех группах с введением Фоллимага, в том числе с обработкой TP03 и ХГЧ (табл. 1). Морфологический анализ яичников показал, что количество предовуляторных фолликулов при обработке крыс обоими индукторами овуляции нарастало в течение 16 ч после их введения. Через 24 ч число предовуляторных фолликулов резко снижалось (TP03) или они вовсе не обнаруживались (ХГЧ) (табл. 1). Желтые тела, соответствующие овуляторным фолликулам, в значимых количествах были выявлены у животных в группах ФТ-24 и ФГ-24, что указывает на индукцию у них овуляции (табл. 1).

Уровень прогестерона в крови существенно повышался через 8 ч после обработки TP03 и ХГЧ, в большей степени в случае ХГЧ (рис. 1а). Повышение уровня прогестерона сохранялось через 16 ч после обработки ХГЧ, но исчезало через 24 ч, что согласуется с данными других авторов об остром пике повышения уровня прогестерона в крови неполовозрелых крыс после введения ХГЧ и последующем его снижении [13, 14]. Рассчитанное значение AUC_4-24 для кривой “концентрация прогестерона (нМ)–время (ч)” в случае ХГЧ существенно превосходило соответствующее значение для TP03 (1208 ± 156 vs. 475 ± 42, p < 0.002). Уровень эстрадиола в группах с обработкой TP03 и ХГЧ, напротив, значимо снижался в сравнении с группой Ф (рис. 1б). Снижение было более эффективным при использовании гонадотропина, на что указывает более низкое значение AUC_4–24 для кривой “концентрация эстрадиола (нМ)–время (ч)” в случае ХГЧ в сравнении с TP03 (6.30 ± 0.74 vs. 9.29 ± 0.72, p < 0.05). О снижении уровня эстрадиола после индукции овуляции с помощью ХГЧ у неполовозрелых крыс сообщали и другие авторы [13, 15]. Одной из причин этого является изменение доступности тестостерона для ароматазы, превращающей его в эстрадиол [15]. Тем самым, динамика стероидогенных эффектов у TP03 и ХГЧ была сходной, но ХГЧ действовал эффективнее.

Полученные данные свидетельствуют о том, что, как и в случае стимуляции тестикулярного стероидогенеза [7, 8], эффект аллостерического агониста TP03 на овариальный стероидогенез является более умеренным в сравнении с ХГЧ, а активность TP03, как индуктора овуляции, выражена в меньшей степени. Однако это имеет определенные преимущества, поскольку позволяет избежать СГЯ, истощения овариального резерва и снижения качества яйцеклеток, которые часто встречаются при использовании ХГЧ [1]. Для сравнительного изучения возможных рисков развития СГЯ при применении TP03 и ХГЧ в яичниках оценивали экспрессию генов VegfA и VegfB, кодирующих VEGF-A и VEGF-B, которые могут являться индукторами СГЯ [11]. Показано, что экспрессия VegfA и VegfB в группе Ф с обработкой одним Фоллимагом снижалась (рис. 2). TP03 и ХГЧ слабо влияли на сниженную в группе Ф экспрессию гена VegfA, за исключением временного интервала 24 ч, когда оба агониста подавляли ее в еще большей степени (рис. 2а). В случае экспрессии гена VegfB ситуация была иной. ХГЧ вызывал значительную ее стимуляцию в сравнении с группой Ф, в то время как TP03 влиял на экспрессию VegfB в небольшой степени, значимо повышая ее только у крыс группы ФТ-16 (рис. 2б). Эти данные свидетельствуют о том, что ХГЧ, несмотря на используемую в нашем исследовании сравнительно невысокую дозу препарата, в течение суток после введения поддерживает высокий уровень экспрессии VEGF-B. Это, в совокупности с более высокой удельной массой яичников на протяжении эксперимента, указывает на существенные риски развития СГЯ, которые часто встречаются при использовании гонадотропинов для контролируемой индукции овуляции [1]. В свою очередь, TP03 существенно не влиял на экспрессию VEGF-B, что может свидетельствовать о низкой ве-роятности развития СГЯ.

Рис. 1.

Изменение содержания прогестерона (а) и эстрадиола (б) в крови неполовозрелых самок крыс в течение 24 ч после введения индукторов овуляции – TP03 и ХГЧ.

В контрольной группе концентрация прогестерона в крови составила 20.9 ± 3.7 нМ, эстрадиола – 0.19 ± ± 0.03 нМ. В опытных группах образцы сыворотки крови получали через 48 ч после стимуляции фолликулогенеза (группа Ф, точка 0) и затем через 4, 8, 16 и 24 ч после индукции овуляции ТР03 (группы ФТ-4, ФТ-8, ФТ-16, ФТ-24) или ХГЧ (группы ФГ-4, ФГ-8, ФГ-16, ФГ-24). Различия значимы при p < 0.05: a – с группой К, b – с группой Ф. Данные представлены как M ± SEM, n = 5 в каждой группе.

Рис. 2.

Экспрессия генов VegfA (а) и VegfB (б), кодирующих изоформы A и B фактора роста эндотелия сосудов, в яичниках неполовозрелых крыс, и влияние на них индукторов овуляции – TP03 и ХГЧ.

В контрольной группе экспрессия генов VegfA и VegfB в яичниках составила 1.03 ± 0.09 и 1.04 ± 0.08 отн. ед., соответственно. В опытных группах ткани яичников получали через 48 ч после стимуляции фолликулогенеза (группа Ф, точка 0) и затем через 4, 8, 16 и 24 ч после индукции овуляции ТР03 (группы ФТ-4, ФТ-8, ФТ-16, ФТ-24) или ХГЧ (группы ФГ-4, ФГ-8, ФГ-16, ФГ-24). Различия значимы при p < 0.05: a – с группой К, b – с группой Ф. Данные представлены как M ± SEM, n = 5 в каждой группе.

Таким образом, нами впервые показано, что TP03, агонист рецептора ЛГ/ХГЧ, взаимодействующий с его трансмембранным аллостерическим сайтом, как и коммерческий препарат ХГЧ, взаимодействующий с внеклеточным ортостерическим сайтом рецептора, характеризуется способностью стимулировать продукцию прогестерона и индуцировать овуляцию у неполовозрелых самок крыс. При этом TP03 в сравнении с ХГЧ действовал на яичники более мягко, в меньшей степени повышая уровень прогестерона в крови и приводя к образованию вдвое меньшего числа желтых тел. В то же время TP03, в отличие от ХГЧ, не вызывал повышения экспрессии гена VEGF-B в яичниках, что минимизирует вероятность развития СГЯ, ассоциированного с активацией VEGF-зависимых сигнальных путей и являющегося одним из тяжелых осложнений при использовании гонадотропинов при осуществлении контролируемой индукции овуляции во вспомогательных репродуктивных технологиях.