Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 512, № 1, стр. 486-494

ВВЕДЕНИЕ

Старение – это процесс, характеризующийся функциональными и морфологическими изменениями, которые приводят к истощению или полному прекращению функционирования клеток, тканей и органов. В частности, в головном мозге происходит ряд инволютивных изменений, которые в процессе физиологического старения могут предрасполагать к формированию когнитивной недостаточности, ухудшению памяти, способности к ориентации в пространстве и др. [1]. В качестве рекомендаций для пожилых людей большинство клиницистов и исследователей советуют избегать стрессовых ситуаций, чтобы не подвергать сердечно-сосудистую систему избыточным нагрузкам. Однако в последнее время эта уверенность во вреде стресса для пожилых людей, у которых в базовом состоянии нет клинической деменции, инсульта и сердечной недостаточности, подвергается сомнению [2].

На текущий момент во всех странах мира отмечается значительный рост такой психопатологии, как посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР). ПТСР – это тяжелое психическое заболевание, возникающее в результате чрезвычайных стрессорных событий, оказывающих сверхмощное негативное воздействие на психику индивида. Наиболее часто ПТСР рассматривается как психотравмирующее последствие пребывания в боевой обстановке, что в наши дни очень актуально [3]. Поскольку в такие ситуации попадают люди преимущественно молодого и среднего возраста, изучение реакции их организма на стресс в приоритете. В связи с этим чрезвычайно мало работ по изучению подверженности старых людей и лабораторных животных развитию ПТСР. Для молодых индивидов и особей достаточно давно установлено, что для этого заболевания более характерно снижение уровня основного гормона стресса – кортикостерона [4]. В то же время до сих пор среди исследователей нет единого мнения о характере изменений уровня тестостерона – основного анаболического гормона, участвующего в перераспределении энергии для обеспечения адаптации молодых людей и животных в ответ на стрессорные воздействия. Информация о характере изменений уровня кортикостерона и тестостерона в крови старых людей и лабораторных животных при ПТСР еще более неопределенна.

Цель данного исследования – изучение особенностей поведения, психоэмоциональных проявлений, изменений уровня кортикостерона и тестостерона в крови, а также морфофункционального состояния миокарда у старых крыс Вистар при моделировании ПТСР.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на аутбредных крысах-самцах Wistar в возрасте 4–5 мес (n = 30, масса тела 210–230 г) и 23–24 мес (n = 30, масса тела 760–850 г). Крыс содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и полноценному гранулированному корму. Первоначально животные были разделены на 4 группы: 1 – интактные молодые животные (n = 10); 2 – молодые крысы, подвергавшиеся предаторному стрессу (n = 20); 3 – интактные старые крысы (n = 10); 4 – старые животные, подвергавшиеся предаторному стрессу (n = 20).

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Директивой Европейского парламента 2010/63/ЕС “О защите животных, используемых в экспериментальных целях” (от 22.09.2010). Исследование одобрено Комитетом по биоэтике Научно-исследовательского института морфологии человека имени академика А.П. Авцына Федерального государственного бюджетного научного учреждения “Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского” (протокол № 34, 2022 г.).

В работе использовали модель ПТСР, описанную H. Cohen и соавт. (2013), модифицированную в наших исследованиях [5, 6]. Предаторный стресс (страх жертвы перед хищником) индуцировали, подвергая крыс воздействию запаха кошачьей мочи в течение 10 мин ежедневно в течение 10 сут. Затем животных помещали в обычные условия вивария на 14 сут. Контрольная группа крыс в течение всех этих 24 сут находилась в состоянии покоя.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Тестирование молодых и старых крыс в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ) весьма ожидаемо выявило снижение показателей поведения, характеризующих подвижность у всех групп старых животных (табл. 1). По сравнению с молодыми, даже особи контрольной возрастной группы проявляли более низкую локомоторную активность и более высокую тревожность, выявляемую по значительно меньшему числу заходов и времени, проводимому в открытых рукавах ПКЛ (р < 0.05, табл. 1). Снижение локомоторной активности и повышение тревожности с возрастом достаточно характерны не только для животных, но и для людей [12, 13]. Комплексный показатель поведения – индекс тревожности (ИТ) –оказался достоверно значимо выше на 24% у контрольных старых крыс (р < 0.005), на 21% у низкотревожных (р < 0.005), значения высокотревожных старых животных не отличались от показателей высокотревожных молодых особей (р > 0.05). Следует добавить, что группы высокотревожных молодых и старых крыс характеризовались наибольшими значениями ИТ, тогда как показатели ИТ низкотревожных групп обоих возрастов не отличались от своих контролей (табл. 1).

На основании сходства этих показателей ИТ и резкого отличия – значительного увеличения ИТ у высокотревожных крыс, было произведено разделение популяций молодых и старых животных на низко- и высокотревожных, как это принято у других авторов и в наших предыдущих работах [6, 14].

Изучая показатели психоэмоциональных проявлений (ПЭП), как и в других наших работах, было отмечено снижение числа ПЭП всех изучаемых категорий во всех группах старых крыс по сравнению с молодыми [15]. Впервые нами установлено, что число ПЭП класса ориентировочных реакций (КОР – контекстных ориентировочных реакций и НКР – контекстных реакций неуверенности, колебаний) у группы старых низкотревожных крыс не отличалось от контрольных значений и было гораздо ниже, чем у молодых особей соответствующих групп (р < 0.01). Особо следует отметить, что значения ПЭП старых крыс из разряда колебаний (неуверенности) при выборе направления движения в ПКЛ, были ниже у контрольных и низкотревожных животных на 35 и 63% соответственно, чем у молодых (р < 0.001). Тем не менее число ПЭП класса ориентировочных реакций у группы высокотревожных старых крыс оказалось на 38% выше, чем в контроле (р < < 0.001) и не имело статистически значимых отличий от показателей соответствующей группы молодых особей (р > 0.05). Стрессирование молодых крыс, в противоположность старым, индуцировало у группы низкотревожных особей возрастание числа ПЭП класса ориентировочных реакций, КОР и НКР на 33 и 63% (р < 0.025 и р < 0.0001 соответственно) и на 53 и 26% (р < 0.0001 и р < < 0.027 соответственно) у группы высокотревожных животных по сравнению с контролем.

Следовательно, возрастание ИТ не мешало старым животным благополучно осваивать пространство приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ) и даже проявлять повышенную способность к поведенческой саморегуляции – быстрее, чем молодые особи принимать решение о направлении движения. Соответственно, механизмы ЦНС, участвующие в процессах ориентации в пространстве и принятии решения о выборе направления движения у старых крыс, в ситуации стресса, работали эффективнее, чем у молодых.

Значения уровня кортикостерона, представленные на рис. 2, свидетельствуют о том, что базовый уровень этого гормона у старых и молодых крыс был практически равнозначным (р > 0.05). После стрессирования у обеих возрастных групп наблюдалось одинаково выраженное снижение уровня кортикостерона в сыворотке крови (рис. 2). По нашим предыдущим работам и сведениям других авторов, снижение уровня кортикостерона является дополнительным доказательством развития ПТСР-подобного состояния [6, 16]. Стоит отметить, что очень мало работ, в которых показано, что ПТСР-подобное состояние формируется не только у молодых, но и у старых крыс Вистар, при этом популяция стрессированных животных разделяется на низкотревожных – устойчивых к стрессу и высокотревожных – неустойчивых к стрессу особей.

Рис. 1.

Соотношение четырех категорий психоэмоциональных реакций молодых и старых крыс Вистар при моделировании ПТСР. АР – активные психоэмоциональные реакции (невротические, стрессовые, смещенные), ПР – пассивные реакции (груминг, сидение), НКР – контекстные реакции неуверенности (колебания в развилках), КОР – контекстные ориентировочные реакции (стойки, остановки). МК – молодые крысы контроль, МНТ – молодые низкотревожные крысы, МВТ – молодые высокотревожные крысы, СК – старые крысы контроль, СНТ – старые низкотревожные крысы, СВТ – старые высокотревожные крысы. ^р < 0.05 – достоверность отличий между группами контроля, *р < 0.05 – между контролем и стрессированными крысами, #р < 0.05 – между группами низкотревожных и высокотревожных крыс, ^&р < 0.05 – между соответствующими группами стрессированных молодых и старых крыс по U-критерию Манна–Уитни.

Рис. 2.

Тестостерон и кортикостерон в плазме крови молодых и старых крыс Вистар при моделировании ПТСР (ммоль/л). Обозначения те же, что и на рис. 1.

Содержание циркулирующего тестостерона у старых интактных крыс было на 44% ниже, чем у молодых особей. Уровень этого гормона характеризовался весьма дифференцированным откликом на стресс. Необходимо подчеркнуть, что при развитии ПТСР-подобного состояния, содержание тестостерона у молодых крыс снижалось: у низкотревожных – на 23% (р < 0.025), а у высокотревожных – на 53% (р < 0.005), тогда как у старых животных наблюдался противоположный процесс – процесс повышения на 38 и 30% соответственно (р < 0.005) по сравнению с их контрольными уровнями (рис. 2).

Снижение уровня тестостерона с возрастом – факт достаточно известный как у людей, так и у лабораторных животных, тогда как разнонаправленный ответ этого гормона при моделировании ПТСР: падение содержания гормона в крови у молодых и скачок его уровня у старых крыс, зарегистрирован нами впервые и это представляет немалый интерес. Аналогичное явление отмечали M. Slimani и соавт. (2018) при обследовании после соревнований молодых и старых бойцов спортивных единоборств. [17]. Возможно такое различие реакции тестостерона связано с бόльшей опытностью старого поколения, у которого закрепились стратегии преодоления стресса.

В связи с тем, что в научной литературе разных лет повышение уровня тестостерона авторы связывают с интенсификацией познавательной деятельности и улучшением способности к ориентации в пространстве. Возможно, в нашем эксперименте рост уровня тестостерона у старых животных обусловил через вторичные мессенджеры хорошую ориентацию в ПКЛ и повышение эффективности работы механизмов принятия решения о выборе направления движения у старых крыс [18].

Очень интересными оказались показатели индекса отношения уровня тестостерона к уровню кортикостерона (табл. 1). У старых интактных крыс этот индекс был значительно ниже (на 55%, р < 0.0001), чем у молодых особей, тогда как показатели обеих групп стрессированных старых животных не имели достоверных отличий от значений соответствующих групп молодых крыс (табл. 1). Примечательно, что показатели низкотревожных животных обеих возрастных групп оказались на 38% выше высокотревожных особей (р < 0.005). Следовательно, анаболические процессы в организме низкотревожных крыс преобладали над катаболическими и механизмы системы адаптации позволяли сохранять баланс гомеостаза в пределах нормы.

Старческий возраст, особенно при стрессе, обычно связывают с развитием, или обострением сердечно-сосудистых заболеваний. В связи с этим мы провели морфофункциональное изучение состояния миокарда у всех групп крыс. Применяя гистохимическую окраску ГОФП по Ли, нам удалось выявить наличие зон гипоксии в миокарде молодых высокотревожных крыс (рис. 3в), небольшие зоны гипоксии у низкотревожных старых животных (3д) и, гораздо большие зоны, в миокарде высокотревожных старых особей (3е). В то же время у контрольных крыс обеих возрастных групп зоны гипоксии не выявлялись (3а, г).

Рис. 3.

Поперечные срезы миокарда молодых (a, б, в) и старых (г, д, е) крыс Вистар. Окраска ГОФП по Ли, ×400. а – контрольные молодые крысы, б – низкотревожные молодые крысы, в – высокотревожные молодые крысы, г – контрольные старые крысы, д – низкотревожные старые крысы, е – высокотревожные старые крысы. Ярко-красный цвет мышечных волокон свидетельствует о развитии гипоксии.

Описательные характеристики срезов миокарда подтвердились количественным методом определения оптической плотности (ОП) ярко-красной окраски ГОФП, идентифицирующей зоны гипоксии. Оказалось, что значения ОП не имели статистически значимых отличий у контрольных групп, а также между низкотревожными молодыми особями и их контролем (рис. 4). Тогда как показатели ОП высокотревожных молодых животных отличались от своего контроля на 37% (р < 0.001), а значения ОП низкотревожных старых крыс оказались совсем незначительно выше контрольных – на 7.4% (р < 0.042), в то время как высокотревожных – на 56% (р < < 0.0001). Следовательно, существенные повреждения миокарда наблюдались у высокотревожных молодых и, особо значительные, у высокотревожных старых животных (рис. 4).

Рис. 4.

Оптическая плотность срезов миокарда молодых и старых крыс Вистар, окрашенных ГОФП по Ли (усл. ед.). Обозначения те же, что и на рис. 1.

Поскольку миокард является тканью с высокой окислительной метаболической активностью, центральную роль в стабилизации оптимальной работы сердца играют митохондрии, а поддержание гомеостаза митохондрий имеет решающее значение для клеточных и органных функций. В связи с этим мы оценивали состояние митохондрий с помощью электронного микроскопа. Анализируя ультраструктуру миокарда, можно отметить, что на продольных срезах всех групп животных видна поперечная исчерченность, характерная для мышечных волокон. У молодых и старых крыс групп контроля миофибриллы равномерной толщины, митохондрии располагаются цепочками между миофибриллами, они имеют хорошо различимые кристы и равномерно окрашенный матрикс (рис. 5а, г). сходное строение наблюдалось у низкотревожных молодых и старых крыс (рис. 5б, д). В то время, как у высокотревожных особей обеих возрастных групп миофибриллы различались по толщине, имели извитую форму, между ними наблюдались просветы, вероятнее всего свидетельствующие о наличии отеков. Митохондрии этих животных имели матрикс более темной окраски (рис. 5в, е, ж). Кроме того, на продольных и, особенно, поперечных срезах старых крыс хорошо заметно, что эти группы крыс характеризуются наибольшим среди всех экспериментальных групп числом митохондрий, которые часто образуют большие скопления, раздвигающие миофибриллы (рис. 5е, ж). Размеры митохондрий у всех групп животных были приблизительно одинаковы.

Рис. 5.

Ультраструктура миокарда молодых (a, б, в) и старых (г, д, е, ж) крыс Вистар. а – контрольные молодые крысы, б – низкотревожные молодые крысы, в – высокотревожные молодые крысы, г – контрольные старые крысы, д – низкотревожные старые крысы,е, ж – высокотревожные старые крысы. Продольные срезы (a, б, в, f, д, е), поперечный срез (ж).

Измерение площади, занимаемой митохондриями (рис. 6), отражающее их число, позволило определить, что у высокотревожных молодых крыс митохондрий было на 22% больше, чем в контроле (р < 0.0001) и на 13%, чем у низкотревожных животных (р < 0.001). Показатели численности митохондрий у всех групп старых крыс были статистически значимо выше, чем у молодых особей (рис. 6). Площадь митохондрий низкотревожных старых животных оказалась немного больше – на 8%, чем в контроле (р < 0.01), а высокотревожных – на 18%, чем в контроле (р < < 0.0001) и на 9%, чем у низкотревожных крыс (р < 0.001, рис. 6).

Рис. 6.

Площадь митохондрий в миокарде молодых и старых крыс Вистар (мкм²). Обозначения те же, что и на рис. 1.

Следовательно, в нашем исследовании при моделировании ПТСР впервые отмечены дисфункциональное накопление митохондрий в миокарде с возрастом и чрезмерное накопление этих органелл у высокотревожных крыс обеих возрастных групп. В норме процесс митохондриальной динамики определяется сбалансированной системой двух противоположных процессов, регулирующих гомеостаз митохондрий – митохондриальным биогенезом и митофагией. Некоторые авторы считают, что митофагия, направленная на деградацию поврежденных митохондрий, играет более важную роль [19]. В нашем эксперименте нам удалось продемонстрировать, что старческий возраст связан с нарушением функционирования механизма митофагии и выявленное дисфункциональное состояние прогрессирует после воздействия стресса. Необходимо подчеркнуть, что это же явление наблюдалось и у молодых высокотревожных крыс. Вероятнее всего, чрезвычайный стресс, аналогичный применяемому нами при моделировании ПТСР, способен нарушить у людей механизмы регуляции митохондриального оборота и это может индуцировать развитие таких сердечно-сосудистых заболеваний, как инфаркт миокарда, кардиомиопатия и сердечная недостаточность. Особенно предрасположенными к таким заболеваниям являются пожилые люди.

Несмотря на выявленные нами небольшие отличия состояния миокарда у старых низкотревожных крыс от контроля, важно указать на существенную разницу морфофункционального состояния миокарда низкотревожных и высокотревожных животных. Судя по всему, полученные данные свидетельствуют о преобладании анаболических процессов в организме низкотревожных крыс над катаболическими, а впервые примененный нами индекс отношения уровня тестостерона к кортикостерону может служить надежным ориентиром для разделения популяции крыс на низко- и высокотревожных особей при моделировании ПТСР.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в данном исследовании у старых крыс Вистар выявлены следующие особенности: более высокие значения индекса тревожности, уплощение психоэмоциональных проявлений (даже у высокотревожных крыс); более низкие показатели контекстных реакций неуверенности, колебаний, свидетельствующие о хорошей ориентации в пространстве и более быстром принятии решения о направлении движения; повышение уровня циркулирующего тестостерона после стресса. Впервые примененный нами индекс отношения уровня тестостерона к кортикостерону может служить надежным ориентиром для разделения популяции крыс на низко- и высокотревожных особей при моделировании ПТСР. Нами установлено, что старческий возраст сказался на состоянии миокарда, в котором были выявлены самые большие зоны гипоксии у всех стрессируемых крыс. Впервые нами зарегистрировано дисфункциональное накопление митохондрий в миокарде всех групп старых крыс, с большой долей вероятности являющееся нарушением функционирования механизма митофагии. После дополнительных исследований дисфункция механизмов регуляции численности митохондрий может стать терапевтической мишенью для поиска лекарственных средств борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями, в частности после стрессорных воздействий.