Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2023, T. 512, № 1, стр. 438-443

Транскрипция у эукариот инициируется в результате осуществления нескольких процессов на промоторных участках генов [1, 2]: деконденсируется хроматин под влиянием инсуляторных белков, собирается транскрипционный комплекс из молекул белков, изменяется структура молекул гистонов за счет посттрансляционных модификаций – отдельные аминокислоты в их составе ацетилируются, метилируются или фосфорилируются [3, 4], начинается синтез РНК (элонгация).

В политенных хромосомах присутствуют три типа морфологических структур: черные и серые диски и междиски между ними [6]. Черные диски состоят из плотно упакованного материала, в то время как серые – из материала разрыхленного, по степени упаковки материала эти два типа дисков различаются примерно в 10 раз [7]. Гены развития расположены в черных дисках, гены домашнего хозяйства занимают две структуры – в междисках промоторы, в соседних серых дисках – тела генов [5, 7].

В результате разработки биоинформатической модели состояний хроматина (4НММ) весь геном дрозофилы был разбит на две группы – около 6.5 тыс. генов с относительно постоянной активностью в ходе развития (гены домашнего хозяйства) и около 3.1 тыс. генов активных только на определенных стадиях онтогенеза или только в определенных тканях (гены развития). С помощью этой же модели структуры интерфазных политенных хромосом (два типа дисков и междисков) были связаны с этими группами генов [5].

Из хроматина черных дисков в конце личиночного развития формируются крупные вздутия – пуфы, т.е. в результате действия стероидного гормона экдизона активируются гены развития, причем активные только в ходе метаморфоза и активацию которых легко наблюдать под микроскопом [9]. Многие из генов, локализованных в пределах хроматина пуфов, кодируют рецепторы гормона, функции других пока неизвестны [10–13].

В данной работе с помощью картирования антител в политенных хромосомах дрозофилы показано, что в процессах инициации и элонгации транскрипции генов домашнего хозяйства и генов развития принимают участие различные группы белков и модифицированных гистонов.

Мы использовали антитела против белка CHRIZ/CHROMO дрозофилы (в дальнейшем CHRIZ, антитела получены в нашей лаборатории), антитела против модифицированных гистонов человека Н3К36me3 (Abclonal, Diagenode), человека и мыши H3S10P (Merck) и антитела против модифицированной формы гистона H4R3me2 человека (Active Motif) (антитела на две последние модификации гистонов любезно предоставлены Н.Е. Воробьевой). Использованные в работе методы ведения дрозофил, приготовления препаратов, разведения антител, окраски, фотографирования, микроскопии и манипуляции с иммунофлуоресценцией проводили как описано ранее в [14].

Белок CHRIZ в политенных хромосомах локализуется в промоторах генов домашнего хозяйства (в политенных хромосомах – в междисках) [5, 8]. Будучи привлеченным в окружение материала черных дисков в составе искусственно созданных генетических конструкций, декомпактизует этот дисковый материал, формируя новый междиск [14], т.е. ведет себя как инсуляторный белок. В качестве первого шага инициации транскрипции в генах домашнего хозяйства является привлечение в район промотора белка CHRIZ –инсулятора, деконденсирующего структуру хроматина. Поэтому мы рассматриваем CHRIZ как абсолютно необходимый компонент для посадки факторов транскипции и РНК полимеразы.

Модифицированный гистон Н3К36ме3 выполняет в геноме дрозофилы многие функции, в том числе участвует в элонгации синтезируемой РНК [15, 16]. На рис. 1 показаны результаты иммунофлуоресцентной колокализации антител на белок CHRIZ и модифицированный гистон Н3К36ме3.

Рис. 1.

Локализация иммунофлуоресцирующих антител на белок CHRIZ (в) и модификацию гистона H3K36 me3 (г) в Х хромосоме у личинок конца третьего личиночного возраста [10] за два часа до начала формирования пупариума. (а) и (б) – фазовый контраст и наложение двух упомянутых окрасок соответственно. Стрелками обозначены экдизон-индуцируемые пуфы, прямыми черточками – черные диски.

Гены домашнего хозяйства в политенных хромосомах расположены одиночно или группами в участках локализации серых дисков/междисков, при этом в междисках лежат промоторы, а в дисках тела этих генов (соответственно зеленая и красная флуоресценция на рис. 1в, г). Окрашивание желтого цвета (из-за наложения красной и зеленой флуоресценции) видно на большей части длины всех хромосом (рис. 1б). Гены развития в политенных хромосомах располагаются в черных дисках (обозначения с черточками на рис. 1а), при активировании этих генов образуются пуфы (обозначены стрелками на рис. 1). В черных дисках и во всех пуфах отмечено полное отсутствие сигналов флуоресценции (рис. 1б) несмотря на то, что, как известно [сводка 10], пуфы – наиболее интенсивно транскрибируемые районы.

На рис. 2 показаны результаты иммунофлуоресцентной локализации антител на белок CHRIZ и модифицированный гистон Н3К36ме3, в хромосомах личинок с более ранней стадии развития, чем на рис. 1. Окраска антител на белок CHRIZ полностью отсутствует в участках локализации генов развития в черных дисках, в пуфах, а также в прицентромерном гетерохроматине (Het на рис. 2), который, как правило, значительно обеднен генами как развития, так и домашнего хозяйства. По этой причине в нем нет как точек инициации, так и элонгации транскрипции.

Рис. 2.

Локализация иммунофлуоресцирующих антител на белок CHRIZ (в) и модификацию гистона H3K36 me3 (г) у личинок на стадии начала формирования пупариума [10]. (а) и (б) – соответственно фазовый контраст и наложение двух упомянутых окрасок. Цифрами и стрелками обозначены экдизон-индуцируемые пуфы, цифрами и прямыми черточками – черные диски.

Антитела на ко-репрессор экдизонового рецептора – модификацию гистона H4R3me2 [17] метят строго участки локализации крупных экдизон-индуцируемых пуфов, независимо от их размеров (красные сигналы на рис. 3а, 4а, б).

Рис. 3.

Иммунофлуоресцентная окраска политенных хромосом антителами (а) на модификацию гистона Н3R3me2 (красный цвет) и белок CHRIZ (зеленый цвет), цифрами и прямыми черточками обозначены большие экдизон-индуцируемые пуфы; (б) на модификацию Н3S10P (красный цвет) и белок CHRIZ (зеленый цвет), цифрами и прямыми черточками обозначены малые и большие экдизон-индуцируемые пуфы, стрелками – черные диски.

Фосфорилирование гистона Н3 в позиции S10 с помощью трансферазы JIL-1 (модификация Н3S10P) специфически необходимо для осуществления ранней элонгации транскрипции (см. обсуждение в [18, 19]). Данные рис. 3б показывают довольно сложное распределение окрасок при совместном использовании антител на CHRIZ: зеленая окраска антител на инсуляторный белок осталась в участках локализации генов домашнего хозяйства, в то время как гены развития поделились на две группы: в наиболее крупных пуфах окраска на Н3S10P не выявлена или слабо выявлена (пуфы в районах 63E, 72D, 74E, 75B, 78C ), в то время как малые экдизон-индуцируемые пуфы, которых в геноме более всего [10], активно метились (красная окраска на рис. 3б, 4в, г). Рис.3

Таким образом, результаты, полученные в данной статье, позволяют высказать предположение о том, что в гомологичных процессах активирования транскрипции в генах домашнего хозяйства и генах развития участвуют разные наборы белков. Рис.4

Рис. 4.

Иммунофлуоресцентное окрашивание пуфов 74E и 75B в линиях Oregon и Rif1¹ антителами на модификацию гистонов H4R3me2 (красный цвет) и белок CHRIZ (зеленый цвет) (а, б) и модификацию H3S10P (красный цвет) и белок CHRIZ (зеленый цвет) (в, г).