Электрохимия, 2021, T. 57, № 1, стр. 59-64
Иммобилизация антибактериального соединения из Streptomyces sp. на многостенных углеродных нанотрубках
Жанну Виней Гопал a, *, Джееван Кумар Редды Модигута b, **, Кришнан Каннабиран c, ***
a Университет Сунь Ятсена, Школа морских наук
Гуанчжоу, Китай
b Кафедра полимерной науки и техники, Департамент конвергенции ИТ-энергии (BK21 FOUR),
Институт химической промышленности, Корейский национальный университет транспорта
23769 Чхунджу, Южная Корея
c Веллурский технологический институт, Школа биологических наук и технологий
632014 Веллуру, Индия
* E-mail: vinaygopal2010@vit.ac.in
** E-mail: tojeevan.sss@gmail.com
*** E-mail: kkb.biomol@gmail.com
Поступила в редакцию 10.09.2019
После доработки 03.02.2020
Принята к публикации 15.05.2020
Аннотация
Пигмент 2,5-ди-трет-бутил-1,4-бензохинон (ДТББХ) селективно иммобилизовали на многостенной углеродной нанотрубке (МУНТ) посредством электрохимического окисления. На стеклоуглеродном электроде (СУЭ), модифицированном хинон/МУНТ, наблюдался стабильный редокс-пик при 50 мВ отн. Ag/AgCl при рН 7. Антибактериальная активность ДТББХ, иммобилизованного на многостенной нанотрубке (гибрид ДТББХ/МУНТ), в отношении Bacillus cereus (МТСС 1168) и Escherichia coli (MTCC 2401) показала высокую минимальную ингибирующую концентрацию в 0.78 и 1.5 мкг/мл в отношении бактериальных патогенов. Полученные данные явно свидетельствуют о иммобилизации ДТББХ на УНТ с выраженными откликами редокс-пиков при –0.01 В (Epa) и ‒0.2 В (Epc) отн. Ag/AgСl. Продемонстрирован новый электрохимический метод иммобилизации веществ на МУНТ, который может найти применение в качестве средства для удаления вредных микробов из окружающей среды.
ВВЕДЕНИЕ
Иммобилизация или удержание электроактивных веществ электрохимическим методом, по сравнению с другими традиционными способами, такими как жидкофазный метод, доказала свою простоту и высокоточную селективность для формирования гибридных материалов [1]. Гибридные материалы, полученные с помощью таких методов, находят важное применение в области электрохимии и электроаналитической химии в качестве электрохимических биосенсоров для мониторинга экологически и биологически значимых химических веществ и загрязнителей [2]. Электрохимические устройства/сенсоры, разработанные с помощью электрохимических методов, преобразуют химические сигналы в электрические сигналы для определения анализируемых веществ [3]. Ключевым фактором в использовании электрохимических методов является применение химически модифицированных электродов (ХМЭ), представляющих собой электроактивные монослои и толстые пленки на проводящих подложках [4]. Существует четыре различных метода изготовления ХМЭ, а именно сорбция (физическая и химическая адсорбция), ковалентно-модифицированные электроды, гомогенные моно/мультислои и гетерогенные мультислои [5].
Углеродные нанотрубки (УНТ) являются одним из самых прочных и гибких материалов, содержащих ковалентную связь между атомами углерода в sp2-гибридном состоянии в гексагональной архитектуре. Они обладают многими привлекательными характеристиками, такими как высокие теплопроводность и электропроводность, механическая прочность и оптические свойства. Эти характеристики делают их полезными материалами для потенциального применения в междисциплинарных областях, таких как молекулярная электроника, биохимические сенсоры, и в качестве добавок в композиционные материалы [6, 7]. Недавние исследования показывают, что УНТ, закрепленные на планарных подложках, могут способствовать прикреплению клеток, дифференциации клеток и длительному выживанию нейронов [8]. В последнее время гибридные наноматериалы, состоящие из УНТ и терапевтических препаратов, представляют огромный интерес в исследованиях и разработках нанотехнологий, биотехнологий, наномедицины, а также в областях экологии и инженерии для оптимизации трансформации и транспортировки лекарств через плотные ткани, в особенности к раковым клеткам, и для применения функционализированных нанотрубок в качестве синтетических трансмембранных пор [9]. В дальнейшем инкапсуляция и иммобилизация органических молекул/фармацевтических препаратов в УНТ открывает новый путь для разработки уникальных гибридных наноструктурированных материалов для перспективных технологических применений, включая системы доставки лекарственных средств [10].
Образование гибридных наноматериалов в результате инкорпорации органических молекул путем инкапсуляции и поверхностной иммобилизации обеспечивается полой трубчатой структурой УНТ. Эти гибридные органические наноматериалы могут быть получены либо жидкофазным методом, либо электрохимическим путем в зависимости от их назначения. Гибридные наноматериалы, состоящие из различных компонентов, были рассмотрены в качестве перспективных платформ для визуализации и биомедицинских приложений [11]. Бета-каротин для улучшения оптических и электронных свойств [12] и фуллерены для биологических применений [13] были получены посредством жидкофазного метода. Благодаря иммобилизации органических молекул в УНТ и их нанесению на проводящую подложку можно получить химический модифицированный электрод для электрохимического применения. В данной работе мы осуществили иммобилизацию производного хинона ДТББХ, выделенного из Steptomyces sp. VITVSK1, на МУНТ. Впервые продемонстрировано, что гибридный материал УНТ–ДТББХ проявляет повышенную антибактериальную активность в отношении B. сereus и E. coli.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Циклическая вольтамперометрия
Для вольтамперометрических измерений использовалась электрохимическая рабочая станция A CHI 660C (США) с трехэлектродной системой (СУЭ) и химически модифицированные электроды на его основе (ХМЭ) в качестве рабочего электрода (0.0707 см2), Ag/AgCl в качестве электрода сравнения, платиновая проволока в качестве вспомогательного электрода). Поверхность СУЭ очищалась механическим и электрохимическим способом. СУЭ полировали 0.5 мкм алюминооксидным порошком с последующей промывкой дистиллированной, деионизованной (ДД) водой и подвергали ультразвуковому воздействию в течение 5 мин. После процесса механической очистки методом циклической вольтамперометрии (ЦВА) поляризовали электрод в течение 10 циклов в диапазоне потенциалов от –0.2 до 1 В отн. Ag/AgCl со скоростью развертки потенциала 50 мВ/с при рН 7 фосфатно-солевого буферного раствора (ФБР). СУЭ/МУНТ был изготовлен посредством капельного нанесения. Для приготовления суспензии 2 мг УНТ добавляли в 500 мкл этанола, после чего подвергали ультразвуковому воздействию в течение 10 мин. Затем на электрод наносили 3 мкл суспензии и высушивали электрод на воздухе в течение 10 мин при комнатной температуре. Для получения СУЭ/Х/МУНТ СУЭ/УНТ подвергали циклированию в диапазоне потенциалов от –0.6 до 0.6 В отн. Ag/AgCl со скоростью развертки потенциала 50 мВ/с в течение двадцати циклов (n = 20, n = № цикла). Продукт (1 мг/100 мкл этанола) экстрагировали путем его растворения в 10 мл ФБР с рН 7, затем его промывали обильным количеством ДД воды, а после перемещали в ФБР с pH 7 для стабилизации СУЭ/Х/УНТ в диапазоне потенциалов от ‒0.2 до 0.6 В отн. Ag/AgCl (n = 20).
СЭМ-анализ/антибактериальная активность
Качественная информация об иммобилизации производного хинона 2,5-ди-трет-бутил-1,4-бензохинона внутри МУНТ была получена из измерений СЭМ (Hitachi, CCMB). Антибактериальную активность ДТББХ, иммобилизованного на многостенной углеродной нанотрубке, в отношении Escherichia coli (MTCC 2401), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) и Bacillus cereus (MTCC 1168) проверяли посредством метода дисков [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Электрохимическое поведение хинона
Метод циклической вольтамперометрии (ЦВА) широко используется в электрохимических биосенсорах, поскольку по своей сути является мощным инструментом исследования. На рис. 1а, соответствующему ЦВА-отклику немодифицированного стеклоуглеродного электрода (СУЭ) в ДТББХ, наблюдается пара редокс-пиков при +0.13 В (Epa) и –0.27 В (Epc) отн. Ag/AgCl. На рис. 1б представлен ЦВА-отклик СУЭ/Х/УНТ в ФБР с рН 7, на котором наблюдается пара хорошо выраженных редокс-пиков при –0.01 В (Epa) и ‒0.2 В (Epc) отн. Ag/AgCl, возникших вследствие иммобилизации ДТББХ на УНТ. Основываясь на предыдущих литературных данных, мы подтверждаем, что наблюдаемые пики отвечают редокс-переходу ДТББХ (2e/2H+) (схема на рис. 1в).
Рис. 1.
Циклическая вольтамперометрия. ЦВА-отклики немодифицированного СУЭ в экстрагированном продукте (Х), растворенном в ФБР при рН 7 и при скорости развертки потенциала – 50 мВ/с (а). ЦВА-отклики СУЭ/Х/УНТ/Х в ФБР при рН 7 и при скорости развертки потенциала – 10 мВ/с (б). Редокс-переход ДТББХ (в).
Описание СЭМ
На рис. 2 показано СЭМ-изображение ДТББХ/МУНТ. Возникновение объемных пятен на стенках МУНТ связано с адсорбцией ДТББХ на поверхности МУНТ. ДТББХ наблюдался на стенках МУНТ с равномерной адсорбцией и с агломерацией некоторых пятен, представленными желтыми кругами, как показано на рис. 2. Sornambikai [15] и др. сообщали о схожей селективной иммобилизации антибиотика амоксициллина на модифицированных электродах из углеродных нанотрубок.
Антимикробное исследование
Антибактериальная активность ДТББХ, иммобилизованного на многостенной углеродной нанотрубке (гибрид ДТББХ/МУНТ), в отношении Bacillus cereus и Escherichia coli продемонстрировала более широкую зону ингибирования по сравнению со стандартным антибиотиком стрептомицином и ДТББХ (рис. 3), что подтверждает усиление антибактериальной активности. Зоны ингибирования, проявляемые стандартным антибиотиком, ДТББХ/МУНТ, приведены в табл. 1. На основании предварительных результатов была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) в табл. 2. Для гибридного материала МУНТ/ДТББХ характерны меньшие значения МИК (0.78 мкг/мл в отношении B. cereus и 1.5 мкг/мл для E. сoli) по сравнению со стандартным антибиотиком и отдельными компонентами гибридного материала. Assali и др. сообщали, что иммобилизация препаратов на нанотрубках значительно усиливает антибактериальную активность. В 2017 г. [16] была описана стратегия иммобилизации одностенных углеродных нанотрубок/ципрофлоксацина для значительного усиления антибактериальной активности.
Рис. 3.
Антибактериальная активность ДТББХ/МУНТ: а – стандарт стрептомицина (10 мкг), б – многостенная нанотрубка (5 мкг), в – ДТББХ (5 мкг), г – ДТББХ/МУНТ (10 мкг).
Таблица 1.
In vitro антибактериальная активность
| Зона ингибирования, мм | ||||
|---|---|---|---|---|
| Тестируемые патогенные микроорганизмы | Стрептомицин (10 мкг) | ДТББХ (5 мкг) |
МУНТ (5 мкг) |
МУНТ/ДТББХ (10 мкг) |
| B. сereus (MTCC 1168) |
17.00 ± 0.05 | 20.00 ± 0.04 | 18.00 ± 0.05 | 28.00 ± 0.04 |
| E. сoli (MTCC 2401) |
15.000 ± 0.004 | 16.000 ± 0.002 | 8.000 ± 0.004 | 21.000 ±0.002 |
Таблица 2.
Минимальная ингибирующая концентрация соединений, оцениваемых в отношении бактериальных патогенов
| Тестируемые патогенные микроорганизмы | Стрептомицин | ДТББХ | МУНТ | МУНТ/ДТББХ |
|---|---|---|---|---|
| B. сereus (MTCC 1168) |
6.25 ± 0.04 | 1.50 ± 0.13 | 12.50 ± 0.03 | 0.78 ± 0.09 |
| E. сoli (MTCC 2401) |
12.50 ± 0.03 | 3.125 ± 0.090 | 50.00 ± 0.08 | 1.50 ± 0.18 |
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Успешно продемонстрирован новый электрохимический способ высокоселективной иммобилизации 2,5-ди-трет-бутил-1,4-бензохинона на углеродной нанотрубке модифицированного электрода. Физико-химическая характеристика ДТББХ/МУНТ в сравнении с немодифицированными системами посредством СЭМ-анализа позволила предположить, что частицы ДТББХ адсорбируются как на внутренних стенках, так и на внешней поверхности МУНТ. Повышенная антибактериальная активность системы ДТББХ/МУНТ показала усиленное действие по сравнению с немодифицированными ДТББХ и МУНТ. Специфическое радикальное взаимодействие внутри матрицы МУНТ было дополнительной причиной повышенной активности.
Список литературы
Bard, A.J. and Falukner, L.R., Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications, Wiley, India, 2006, p. 580–581.
Barry, R.C., Lin, Y., Wang, J., Liu G., and Timchalk, C.A., Nanotechnology-based electrochemical sensors for biomonitoring chemical exposures electrochemical sensors for biomonitoring, J. Expo. Sci. Environ. Epid., 2009, vol. 19, p. 1.
Umasankar,Y. and Chen, S.M., A Review on the Electrochemical Sensors and Biosensors Composed of Nanowires as Sensing Material, Sensors., 2008, vol. 8, p. 290.
Zen, J.M., Kumar, A.S., and Tsai, D.M., Recent updates of chemically modified electrodes in analytical chemistry, Electroanal., 2003, vol. 15, p. 1073.
Zen, J.M., Senthil Kumar, A., and Tsai, D.M., Recent Updates of Chemically Modified Electrodes in Analytical Chemistry, Electroanalysis.,2003. vol. 15, p. 1073.
Avouris, P., Molecular Electronics with Carbon Nanotubes, Acc. Chem. Res., 2002, vol. 35, 12, p. 1026.
Schroeder, V., Savagatrup, S., He, M., Lin, S., and Swager, T.M., Carbon Nanotube Chemical Sensors., Chem Rev., 2019, vol. 119(1), p. 599.
Lee, W. and Parpura, V., Wiring neurons with carbon nanotubes, Front. Neuroengg., 2009, vol. 2, p. 1.
Chen, J., Chen, S., Zhao, X., Kuznetsova, L.V., Wong, S.S., and Ojima, I., Functionalized single walled carbon nanotubes as rationally designed vehicles for tumor-targeted drug delivery, J. Am. Chem. Soc., 2008, vol. 130, p. 16778.
Zhang, X., Meng, L., Lu, Q., Fei, Z., and Dyson, P.J., Targeted delivery and controlled release of doxorubicin to cancer cells using modified single wall carbon nanotubes, Biomaterials, 2009, vol. 30, p. 6041.
Pashow, K.M.L., Rocca, J.D., Huxford, R.C., and Lin, W., Hybrid nanomaterials for biomedical applications. Chem. Commun., 2010, vol. 46, p. 5832.
Yanagi, K., Miyata, Y., and Kataura, H., Highly stabilized β-carotene in carbon nanotubes, Adv. Mater., 2006, vol. 18, p. 437.
Smith, B.W., Monthioux, M., and Luzzi, D.E., Encapsulated C60 in carbon nanotubes, Nature, 1998, vol. 396, p. 323.
Holder, I.A. and Boyce, S.T., Agar well diffusion assay testing of bacterial susceptibility to various antimicrobials in concentrations non-toxic for human cells in culture, Burns., 1994, vol. 20, p. 426.
Senthil Kumar, A., Sornambikai, S., Deepika, L., and Zen, J.M., Highly selective immobilization of amoxicillin antibiotic on carbon nanotube modified electrodes and its antibacterial activity, J. Mater. Chem., 2010, vol. 20, p. 10152.
Assali, M., Zaid, A.N., Abdallah, F., Almasri, M., and Khayyat, R., Single-walled carbon nanotubes-ciprofloxacin nanoantibiotic: strategy to improve ciprofloxacin antibacterial activity, Int. J. Nanomedicine, 2017, vol. 12, p. 6647.
Дополнительные материалы отсутствуют.
Инструменты
Электрохимия
Пн.-пт.: 10.00-19.00