Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2019, T. 55, № 3, стр. 172-178

ВВЕДЕНИЕ

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ; L-лактат: НАД-оксидоредуктаза; КФ 1.1.1.27) является внутриклеточным энзимом, находящимся практически во всех тканях и органах организма. Этот фермент, участвуя в конечных этапах превращения глюкозы в гликолизе, катализирует обратимую реакцию превращения пирувата в лактат при участии НАДH. Изменение активности ЛДГ в структурах головного мозга в ответ на воздействие неблагоприятных факторов среды, в том числе и гипоксии в плодном периоде, представляет определенный интерес. Гипоксия относится к широко распространенным и важным в клиническом отношении неблагоприятным факторам воздействия на организм. Патогенетический эффект гипоксии зависит от периода пренатального развития. Любое воздействие на определенном этапе пренатального онтогенеза откладывает отпечаток на последующее развитие головного мозга [1]. Проявление неврологических и интеллектуальных расстройств в постнатальном онтогенезе вследствие воздействия стресс-факторов в критические периоды пренатального развития, скорее всего, связано со снижением репаративных процессов в головном мозге в пре- и постнатальном онтогенезе [2]. В это же время происходят резкие изменения и в энергетическом обмене ЦНС. Из литературных источников известно, что большая часть поступающего в организм кислорода используется мозгом для обеспечения протекающих в нем биохимических реакций энергоснабжения, поэтому мозг по сравнению с другими органами является наиболее чувствительным к гипоксии [3–6].

Реакция, катализируемая ЛДГ, является заключительным этапом анаэробного механизма окисления глюкозы. Так как энергетический обмен в головном мозге протекает с высокой интенсивностью, то изменения активности ЛДГ, с одной стороны, нарушают, в основном, энергозависимые процессы и приводят организм к патологическому состоянию [7]. С другой стороны, ЛДГ-зависимые реакции считаются наиболее приемлемыми системами для исследования изменений соотношения аэробных и анаэробных процессов, происходящих в живых организмах при различных неблагоприятных воздействиях окружающей среды. В анаэробных условиях образующийся в тканях при гликолизе пируват при участии фермента ЛДГ превращается в лактат, что приводит к снижению внутриклеточного рН и возникновению ацидоза, нарушающего протекание биохимических процессов [8]. Необходимо отметить, что скорость и направление ЛДГ-реакций являются показателями соотношения между интенсивностью гликолиза и скоростью использования пирувата в цикле трикарбоновых кислот, глюконеогенезе и в других реакциях. Молекулярное преобразование тетрамера фермента ЛДГ с изменением соотношения Н- и М‑субъединиц сопряжен с анаэробизацией гликолитического цикла и, следовательно, ЛДГ-зависимые реакции можно использовать как маркер для исследования изменений, происходящих в соотношении аэробных и анаэробных процессов в мозговой ткани при гипоксии. Также можно предположить, что фермент ЛДГ на уровне ЦНС для регуляции механизмов энергообеспечения и внутриклеточной пластичности на генетическом уровне регулируется двумя системами – сигнальной (цитомембранной) и цитоплазматической (транс-крипционной) и повышение активности ЛДГ в мозге можно объяснить ускорением гликолитического пути обмена углеводов. Повышение содержания накапливающегося в результате гипоксии лактата вызывает активацию анаэробных изоферментов ЛДГ_4,5 и одновременное ингибирование аэробных ЛДГ_1,2 из-за различия их кинетических свойств, т.е. аэробно-анаэробное соотношение фракций ЛДГ изменяется в зависимости от возраста животного, структурных особенностей отдела мозга и срока гипоксии [9]. При этом можно сказать, что активация ЛДГ сопряжена с анаэробизацией спектра ее изоферментов.

Влияние гипоксии на физиологические и биохимические характеристики широко изучено у взрослых животных, однако в раннем периоде постнатального развития этот вопрос освещен недостаточно, особенно в области нейрохимических исследований структур головного мозга на субклеточном уровне в зависимости от возраста [1, 10]. Поскольку энергетический баланс головного мозга на 80% обеспечивается глюкозой, мы попытались проанализировать действие гипоксии на гликолиз, а именно, на динамику активности фермента энергообмена ЛДГ в структурах головного мозга крыс в различные периоды постнатального онтогенеза, подвергнутых воздействию пренатальной гипоксии в плодном периоде развития.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

В качестве объекта исследований использовали белых нелинейных крыс, подвергшихся гипоксии внутриутробно в 18–20 дни плодного периода, характеризующегося снижением уровня пролиферации клеток в мозге, ускорением процессов их созревания и дифференцировки. Воздействие гипоксии в этот период приводит к эмбриотоксическим последствиям и различным патологиям развития [5]. Беременные самки были разделены на 2 группы: 1 – контрольная – самки (n = 5), помещавшиеся в барокамеру на 18–20-е сутки беременности при свободном доступе атмосферного воздуха; 2 – опытная – самки (n = 8), подвергавшиеся в барокамере гипоксии в аналогичные сроки беременности. Модель гипоксии создавали у беременных крыс в барокамере с подачей смеси газов 5% кислорода и 95% азота и ежедневной экспозицией 20 мин в течение 3 сут. Полученное от самок обеих групп потомство было в дальнейшем использовано для исследований по достижении 17-го (период прозревания); 30-го (период отъема детенышей от матери, завершение раннего периода постнатального онтогенеза) и 90-го (репродуктивный период) дня постнатального онтогенеза. Отметим, что как в контроле, так и в опыте каждой возрастной группы было использовано по 6 крысят-самцов. По окончании каждой серии опытов крыс декапитировали, извлекали головной мозг на льду и идентифицировали структуры головного мозга [11]. Поскольку энергетический обмен происходит в митохондриях и цитозоле, то посчитали целесообразным провести сравнительный анализ динамики активности ЛДГ в этих субклеточных фракциях, а также в гомогенатах тканей орбитальной, сенсомоторной, лимбической коры, гипоталамуса и мозжечка головного мозга крыс. Ткани структур мозга гомогенизировали в буферной среде, состоящей из 0.2 М трис- НСl (рН 7.4); 1 mМ ЭДТА; 0.25 М сахарозы в соотношении 1:9, и центрифугировали в течение 10 мин при 1000 g. Далее митохондриальную и цитозольную фракции выделяли дифференциальным центрифугированием. Для этого супернатант центрифугировали при 11  000–14  000 g в течение 20 мин, после чего в осадке остается митохондриальная масса, а из супернатанта ультрацентрифугированием при 100  000 g в течение 1.5–2.0 ч выделяли цитозольную субфракцию. Митохондрии после повторного ресуспендирования в 5 мл 0.32 М сахарозы осаждали центрифугированием при 14 000g. Для определения максимальной внутримитохондриальной активности ЛДГ мембраны митохондрий разрушали 1%-ным раствором Тритона Х-100/0.25 М сахарозы [12]. Активность фермента ЛДГ определяли по методу Bergmeyer H.U. (1975) спектрофотометрически при λ = 340 нм [13]. Удельную активность фермента считали как µM NADH/1 мг белка в 1 мин. Содержание общего белка определяли по Брэдфорд с использованием 0.01%-ного раствора Кумасси бриллиантового синего G-250 при λ = = 595 нм [14]. Обработка данных проводилась в программе Origin Pro 7.0. Статистическую обработку проводили с использованием пакета анализа программ Statisticа. Оценка значимости различий данных между группами проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при значениях р < 0.01.

В процессе экспериментов соблюдались правила гуманного обращения с экспериментальными животными, изложенные в директиве Европейского сообщества (Директива Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС)), под наблюдением локального комитета по биоэтике НАН Азербайджана.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты проведенных исследований динамики удельной активности ЛДГ в гомогенатах тканей структур головного мозга у интактных животных показали, что активность фермента на 30-е сутки постнатального онтогенеза резко снижалась, в то время, как на 17-й и 90-й дни развития она достигала своего максимального значения (рис. 1а). В митохондриях активность ЛДГ на 90-й день постнатального развития была в 6–25 раз выше, по сравнению с показателями активности на 17-й и 30-й дни развития (p < 0.001). Исключение составила лимбическая кора, где разница в уровне активности ЛДГ по сравнению с показателями на 30‑й день была незначительной (рис. 1б). В цитозольной фракции изучаемых структур так же, как и в митохондриях, активность ЛДГ на 90-й день развития была выше, чем в предыдущие дни исследования, за исключением орбитальной коры, где на 17-й день активность фермента была в 2–3 раза выше, чем в последующие сроки развития (p < 0.001) (рис. 1в).

Рис. 1.

Изменение удельной активности ЛДГ в тканях (а), митохондриях (б) и цитозоле (в) структур головного мозга контрольных крыс в онтогенезе (µMNADH/мг белка ×1 мин; М ± m; n = 6).

Примечание: 1. ОК – орбитальная кора; СМК – сенсомоторная кора; ЛК – лимбическая кора; Г – гипоталамус; М – мозжечок;

2. * – p < 0.05; ** – p < 0.01; *** – p < 0.001 – значения достоверности, отражающие различия в активности ЛДГ относительно значения предыдущей возрастной группы.

У крыс, перенесших пренатальную гипоксию, в гомогенатах всех исследуемых структур головного мозга активность ЛДГ значимо повысилась на 17-е и 30-е сутки жизни, тогда как после достижения половой зрелости на 90-е сутки жизни ее активность снизилась (рис. 2а).

Рис. 2.

Изменение удельной активности ЛДГ в тканях (а), митохондриях (б) и цитозоле (в) структур головного мозга экспериментальных крыс в онтогенезе в % от показателей контрольной группы соответствующего возраста (М ± m; n = 6).За 100% приняты значения удельной активности ЛДГ в контроле для каждой возрастной группы в отдельности.

* – p < 0.05; ** – p < 0.01; *** – p < 0.001 – значения достоверности, отражающие различия в активности ЛДГ относительно значения у контрольных крыс соответствующего возраста.

В митохондриальной субклеточной фракции структур головного мозга гипоксированных крыс картина динамики активности ЛДГ иная: резко повышаясь на 17-е сутки (p < 0.001), далее на 30-е и 90-е сутки жизни ее активность снизилась (p < < 0.001; 0.01). Исключение составила сенсомоторная кора, где картина динамики активности ЛДГ схожа с таковой в гомогенате данной структуры (рис. 2а, 2б). Точнее, с увеличением возраста при достоверном повышении активности ЛДГ на 17-й день жизни в 5 раз (р < 0.001), и к 30-му дню в 7.5 раза (р < 0.001), на 90-й день ее активность была почти в 3.6 раза ниже контрольных показателей и составила 27% (р < 0.01) (рис. 2б).

В цитозольной субклеточной фракции исследуемых структур головного мозга гипоксированных крыс в постнатальном онтогенезе активность ЛДГ меняется неоднозначно. Результаты показали, что общая картина динамики активности ЛДГ в сенсомоторной коре и гипоталамусе схожа – активность ЛДГ в онтогенезе уменьшается, но до контрольных значений не доходит. В лимбической коре и мозжечке при максимальном повышении активности ЛДГ на 17-е сутки (р < 0.001), далее на 30-е сутки она снижалась с последующим повышением в репродуктивном периоде на 90-е сутки. В орбитальной коре максимальная активность фермента на 30-е сутки была выше контроля в 6 раз (р < 0.001), на 17-е и 90-е сутки жизни активность фермента была ниже, чем на 30-е сутки, но по сравнению с контролем в 4.5 раза выше (р < 0.01; р < 0.001 соответственно) (рис. 2в).

С другой стороны, абсолютные показатели удельной активности ЛДГ в гомогенате структур 17-дневных крысят контрольной группы были выше, чем в митохондриях и цитозоле. У экспериментальных животных данной возрастной группы эти показатели по сравнению с контролем были повышены в несколько раз и особенно в цитозоле корковых структур (р < 0.01) (рис. 1, 2).

У 30-дневных крысят контрольной группы удельная активность ЛДГ в гомогенате и митохондриях была ниже, чем у 17-дневных крысят. В цитозоле же, наоборот, активность ЛДГ была повышена во всех структурах, кроме орбитальной коры (рис. 1). В экспериментальной группе крыс этой же возрастной группы как в гомогенате, так и в субклеточных фракциях наблюдалось достоверное повышение активности фермента по сравнению с контрольными показателями 30-дневных крыс. По сравнению с 17-дневными гипоксированными животными, у 30-дневных гипоксированных крыс повышение активности ЛДГ регистрировалось лишь в цитозоле (рис. 1, 2).

У 90-дневных крыс контрольной группы активность ЛДГ была, в основном, повышенной как в тканях, так и в субклеточных фракциях структур мозга по сравнению с 17- и 30-дневными животными (р < 0.001). У 90-дневных крыс экспериментальной группы при снижении активности ЛДГ в тканях и митохондриях, в цитозоле наблюдалось достоверное повышение активности фермента по сравнению с контролем (р < 0.001). При сравнении же с данными для 17- и 30-дневных гипоксированных крысят активность ЛДГ в гомогенатах структур мозга 90-дневных крыс снижалась; в митохондриях при повышении ее уровня в лимбической коре и мозжечке в других структурах она также снижалась; в цитозоле активность фермента повышалась (рис. 1, 2).

ОБСУЖДЕНИЕ

В наших исследованиях с увеличением возраста у крыс, перенесших перинатальную гипоксию, восстановление активности ЛДГ до контрольных показателей не наблюдается, и в большинстве случаев активность фермента в структурах головного мозга повышается. Полученные результаты можно объяснить тем, что исследуемые структуры мозга способны адаптироваться к изменениям, т.е. в ответ на воздействие гипоксии усиливать защитно-адаптивную функцию и аккумулировать энергию. При этом динамика активности фермента в возрастном ряду 17 → 30 → 90 дней схожа в гомогенате всех исследуемых структур головного мозга (рис. 2а). Вместе с тем в цитозольной фракции динамика активности ЛДГ в зависимости от возраста более плавная, чем в тканях, что, вероятно, может быть объяснено гомогенностью данной фракции (рис. 2в). Совсем иная картина в митохондриях структур мозга. Здесь с увеличением возраста динамика фермента в структурах изменяется неоднозначно: максимум активности ЛДГ достигается на 17-й день постнатального развития, снижаясь с увеличением возраста, за исключением показателей в сенсомоторной коре (рис. 2б).

Неравномерное изменение активности фермента ЛДГ в митохондриях и цитозоле с увеличением возраста животного предположительно зависит от морфофункциональных и физиологических особенностей изучаемых структур в каждой конкретной возрастной группе (рис. 2б, 2в). Также не исключено, что в процессе развития организма преобладание активности ЛДГ в субклеточных фракциях меняется, т.е. наблюдается эффект инверсии, и после воздействии неблагоприятных факторов среды этот процесс может быть более интенсивен.

Таким образом, имеются несколько возможных объяснений полученных результатов. Так, в ответ на гипоксию в головном мозге образуется белок НIF-1, который участвует в регуляции транскрипции более чем 60 белков, в том числе и гликолитических ферментов [15–17]. Вследствие того, что головной мозг является органом, управляющим основными функциями, удовлетворение его энергетических потребностей осуществляется в первую очередь. Как известно, гликолитические процессы в мозговой ткани протекают в аэробных условиях, а ЛДГ является единственным ферментом, который участвует в гликолизе в анаэробных условиях. Этой особенностью фермента можно объяснить повышение анаэробных фракций в изоферментном спектре ЛДГ в мозговой ткани после воздействия гипоксии.

Резюмируя сказанное, можно предположить, что после пренатальной гипоксии активность ЛДГ преимущественно повышаясь на 17-, 30- и 90-е сутки постнатального онтогенеза по сравнению с контрольными показателями в соответствующей возрастной группе, указывает на подключение защитно-адаптационных функций головного мозга. Также результаты экспериментов показали, что в цитозольной фракции изучаемых структур головного мозга активность ЛДГ в основном выше, чем в гомогенатах тканей этих структур. В то же время наблюдалась существенная схожесть показателей активности ЛДГ в гомогенате и цитозоле мозжечка: в обоих случаях активность фермента была самая низкая по сравнению с другими структурами мозга (рис. 2а, 2в). Наряду с этим имело место как увеличение, так и уменьшение активности ЛДГ, например, для гомогената тканей структур мозга на 90-е сутки. Это, возможно, объясняется тем, что при достаточном количестве ресурсов наблюдаются активизация защитно-адаптационных механизмов и повышение активности ЛДГ, то есть происходит анаэробизация ЛДГ. В то время как при истощении ресурсов наблюдается обратная реакция – снижение активности фермента.

Полученные данные свидетельствуют о том, что после воздействия пренатальной гипоксии обменные процессы в головном мозге в ранние периоды постнатального развития перестраиваются. Повышение активности ЛДГ в гомогенатах тканей структур мозга можно объяснить, с одной стороны, возможным нарушением цепи гликолиза на стадии образования глицеральдегид-3–фосфата, который утилизируется более интенсивно для обеспечения тканей структур мозга кислородом при гипоксии. При этом НАД⁺ восстанавливается, выступая в роли акцептора электронов. Усиленное восстановление НАД, основного субстрата ЛДГ, вызывает активацию пула ЛДГ для восстановления баланса [НАД⁺]/[НАДH]. В митохондриях изучаемых структур головного мозга активность фермента в контрольной группе была значительно ниже, чем в цитозоле идентичных структур мозга. И здесь нужно отметить тот факт, что соотношение субстратов ЛДГ [НАД+]/[НАДН] в митохондриях приблизительно в 100 раз ниже, чем в цитозоле. При гипоксии наиболее уязвимыми, прежде всего, оказываются цикл трикарбоновых кислот и цепь переноса электронов. Исходя из этого, можно предположить, что при гипоксии мозг смещает нормальный баланс между гликолизом и дыханием в пользу гликолиза. Полученные нами данные показывают, что эффект гипоксии по-разному реализуется в структурах головного мозга. Это, по-видимому, связано с морфофункциональными особенностями этих структур и каталитической активностью ЛДГ в них. Резкая активация ЛДГ в митохондриях у 17-дневных экспериментальных крыс в этот ранний период онтогенеза, для которого характерно открытие глаз, прозревание, миелинизация – процессы, требующие больших затрат энергии – отражает значительное увеличение потребности головного мозга в АТФ.

С другой стороны, как известно, гипоксические повреждения развивающегося мозга могут приводить к гибели или психическим и нейродегенеративным заболеваниям в постнатальном онтогенезе [18]. Гипоксия может индуцировать экспрессию генов, пагубную для организма. Многие ферменты гликолиза, кодируются чувствительными к гипоксии генами [19]. Индукция их экспрессии происходит главным образом на ранних этапах гипоксического воздействия. Это свидетельствует о том, что активация гликолиза является острым ответом плода на гипоксию, призванным компенсировать недостаток энергии [19]. Авторы, рассматривая современные представления о возможных механизмах трансгенерационной передачи эффектов антенатального стресса и по мере изучения этой проблемы, выяснили, что во время беременности влияние неблагоприятных факторов на потомство не ограничивается одним поколением. В связи с этим вопрос о наличии трансгенерационных эффектов антенатального стресса, регистрируемых не только в первом (F1), но и в последующих поколениях (F2–F4), стал актуальным [19]. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что последствия гипоксического воздействия могут быть необратимыми и наследуемыми. В наших исследованиях с увеличением возраста крыс даже на 90-й день в ответ на гипоксию восстановления активности ЛДГ до контрольного уровня не происходило.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу действия гипоксии по оксидативному механизму. Изучение особенностей динамики изменения активности ЛДГ в структурах мозга после пренатальной гипоксии может внести определенную ясность в механизмы редокс-сдвигов в головном мозге в зависимости от возраста.

Суммируя все выше изложенное, можно заключить:

1. В процессе постнатального онтогенеза у крыс, перенесших пренатальную гипоксию в 18–20-й дни развития, не наблюдается восстановление активности фермента ЛДГ в структурах головного мозга до контрольных показателей.

2. С увеличением возраста у крыс, гипоксированных в 18–20-й дни пренатального развития, активность ЛДГ в основном повышается, что можно объяснить анаэробизацией фермента, необратимостью изменений, вызванных гипоксией, активизацией защитно-адаптационных механизмов и, как следствие этого, переходом изученных структур мозга на иной путь энергообеспечения.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов изучения.